【正文】 第二節(jié)基因工程的基本技術(shù) 有毒試劑 基因工程實驗安全 溴化乙錠（ EB）： DEPC(焦碳酸二乙酯 ):強有力的蛋白質(zhì)變性劑 丙烯酰胺：有毒，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng) 過硫酸酸銨：對粘膜和上呼吸道、眼睛和皮膚有較大危害性，吸入可致命。 紫外線 紫外分析儀 紫外滅菌 放射線 放射性同位素 氯化銫：（重金屬）可因吸入、咽下或皮膚吸收而危害健康。 甲醛：毒性較大且易揮發(fā)，也是一種致癌劑 酚、氯仿：蛋白質(zhì)變性劑 轉(zhuǎn)基因生物 水電安全 需注意防止污染 微生物污染 DNA、 RNA污染 其他污染 儀器的正確操作 微量移液器 離心機 滅菌鍋 蒸餾水器 電子天平 由于提取 DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實驗條件等不同， DNA的提純有很多方法。 一 DNA的提取與純化 （一）、質(zhì)粒 DNA的提取 plasmid DNA The genomic DNA of E. coli: a single circular doublestranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell. Genomic DNA 閉合環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA，在變性后不會分離，復性快； （ 1） 原理 1 .堿抽提法提取質(zhì)粒 DNA DNA雙鏈 變性 DNA單鏈 復性 強堿 中性 染色體 線性 DNA和或 有缺口 的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì) — SDS復合物結(jié)合在一起，在離心的時候 沉淀 下去。 變性 （ 2） 所用的試劑作用 ① 溶菌酶 能水解菌體細胞壁的主要化學成分 肽聚糖 中的 ?1， 4糖苷鍵 。 在堿性條件（ pH8）下有活性。 ② 葡萄糖 增加溶液的 粘度 ，維持 滲透壓 ，防止DNA受機械力（震蕩）的作用而降解。 ③ EDTA Mg2+、 Ca 2+的螯合劑，可抑制 DNA酶 的活性，防止 DNA被酶降解。 ④ NaOHSDS NaOH：強堿，提供 pH12的堿性條件，使 DNA雙鏈 變性 。 SDS: 溶解細胞膜蛋白和細胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成 “ 蛋白 — SDS”復合物 ，使蛋白質(zhì)（包括 DNA酶）變性沉淀。 冰醋酸把醋酸鈉溶液的 pH調(diào)到 。 用來 中和 NaOH變性液，使 DNA復性。 高濃度的 NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、 DNA、 RNA等）沉淀。 用于 沉淀 DNA。 ⑥ 乙醇 DNA用于 沉淀 DNA分子以 水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去 DNA分子的水環(huán)境。 ⑤ NaAcHAc緩沖液 ⑦ RNase A 降解 RNA。 以免提取后的 DNA中含有小分子的 RNA。 ⑧ TE緩沖液 DNA保存 液。 由 TrisHCl和 EDTA配制。 TrisHCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖業(yè)），有利于以后操作； EDTA抑制 DNA酶，防止 DNA被酶降解。 蛋白變性劑 ，進一步抽提 DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。 但苯酚會殘留在 DNA溶液中。 （現(xiàn)多用各種商品化的 層析柱 純化 DNA)。 ⑨ 酚 氯仿 選用 以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。 （ 3）堿抽提法提取質(zhì)粒 DNA的步驟 Solution I 的配制： 使用 “ 溶液 Ⅰ ”溶解細菌細胞壁。 第一步：溶菌 50mM葡萄糖， 25mM TrisHCl()， 10mM EDTA， 45mg/ml溶菌酶 ， RNase A 溶液 II 破壞細胞膜，蛋白質(zhì)和 DNA變性。 第二步：破膜，蛋白質(zhì)和 DNA變性 Solution II 的配制： 第三步：中和 溶液 III使 DNA復性、并促使蛋白質(zhì) SDS復合物和染色體 DNA、 RNA沉淀。 Solution III的配制： NaOH， %SDS 3M 醋酸鈉（用冰醋酸調(diào) pH至 ） 最重要的是： 2. 影響質(zhì)粒 DNA產(chǎn)量的因素 菌株的遺傳背景， 質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。 一般要使用 endA基因 發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如 DH5?、 JM10 XL1Blue等。 （ 1）受體菌株 endA基因編碼 核酸內(nèi)切酶 Ⅰ ， 在 Mg2+的存在下可將雙鏈 DNA消化成 7bp的寡核苷酸片斷。 這是直接決定 DNA產(chǎn)量的重要因素之一。 （ 3）質(zhì)粒大小 分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。 （ 2）質(zhì)粒拷貝數(shù) 質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定 。 若干常用質(zhì)粒的理論產(chǎn)量 質(zhì)粒名 分子大小 bp 拷貝數(shù) 質(zhì)粒產(chǎn)量?g/ml pGEM pUC pBR322 ColE1 pACYC pSC101 2700 2700 4400 4500 4000 9000 300700 500700 25 15 ≈10 ≈6 ≈ ≈ （二）、基因組或其他 DNA的提取 DNA的制備 大腸桿菌基因組 DNA 一般過程及原理： （ 1）細胞裂解 10%SDS和蛋白酶 K。 37 ℃ 溫育。 不用 NaOH ! （ 3）沉淀 DNA 。 （ 2） DNA純化 CTAB(十六烷基三甲基溴化銨 )除去 多糖 ，酚 氯仿 異戊醇除去 蛋白 。 苯酚 2次 酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇 25∶ 24 ∶ 1 1次 氯仿 ∶ 異戊醇 24 ∶ 1 1次 一般過程及原理： 動物組織剪成小塊，置 液氮 中凍結(jié)后 研磨 成細粉末。 組織培養(yǎng)的細胞用 胰酶 消化松散后直接使用。 （ 1）組織粉碎 2. 哺乳動物細胞基因組 DNA的抽提 %SDS和 。 50 ℃ 溫育。 （ 2）細胞裂解 （ 3）純化 DNA 用苯酚和酚 氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。 SDS是離子型去垢劑（ detergent），可以使細胞膜崩解。也是蛋白質(zhì)變性劑。 苯酚 2次 酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇 25∶ 24 ∶ 1 1次 氯仿 ∶ 異戊醇 24 ∶ 1 1次 （ 5）除去 RNA污染 用 RNase。 用 2倍體積的無水乙醇。 （ 4）沉淀 DNA （可以加入 1/10體積的 3M醋酸氨 輔助沉淀） 一般過程及原理： （ 1）組織粉碎 用 液氮 冷凍后 研磨 成細粉末。 3. 從植物組織中制備 DNA （ 2）細胞裂解 用 2%CTAB / 2ME (十六烷基三甲基溴化銨 /2巰基乙醇）。 或 1% SDS和蛋白酶 K。 65 ℃ 溫育。 CTAB即十六烷基三甲基溴化銨，是一種 陽離子去污劑 ，在高離子強度的溶液里， CTAB與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸。因此， CTAB可以用于從大量產(chǎn)生粘多糖的有機體如植物以及某些革蘭氏陰性菌（包括 ）中制備純化 DNA 。 巰基乙醇 作為還原劑使多酚氧化酶失活，可以防止酚類的氧化。 用 異丙醇 （ 20 ℃ ）。 （ 3）純化 DNA 用苯酚和酚 氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。 （ 4）沉淀 DNA （ 5）除去 RNA污染 用 RNase A。