【正文】 中的總 DNA，將會得到許多非特異性產(chǎn)物，反映了該引物序列在基因組中的分布狀況。 （ 3）基因組的比較研究 比較不同物種之間的基因組特征和相似性。 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（ RFLP）分析。 RAPD (Random amplified polymorphism DNA) 1970年人們就有足夠的理論知識來提出目前所用的快速 DNA序列分析法。但當時在認識上和技術(shù)上存在兩個問題： 1. 當時沒有能把不同長度的 核苷酸片段分離開 的技術(shù)。 2. 當時的分析思路局限于 RNA序列分析法。 五 DNA序列分析 （ 1965年 Cornell大學(xué)的 . Holley等首次測定了75bp的酵母丙氨酸 tRNA全序列。使用的是降解片段法）。 Sanger等 1977年發(fā)明。 (一 )、雙脫氧鏈終止法 Frederick Sanger, 1980年 Nobel Prize化學(xué)獎 （ 1） DNA復(fù)制是以一條鏈為模板，按 堿基配 對 的原則進行的。 （ 2）脫氧核糖的連接是以 3’?5’磷酸二脂鍵 。 （ 3）復(fù)制反應(yīng)可以在 體外 進行。 （ 4） 2’和 3’雙脫氧的 ddNTP會使復(fù)制反應(yīng)終 止。 1. 原理 （ 1）制備單鏈 DNA模板 2. 技術(shù)要點 就是待測序的 DNA鏈。 ① 不能有 5’?3’和 3’?5’的外切酶活性； ② 與模板的親和力高，不會提前脫離模板。 （ 2）特殊的 DNA多聚酶 dNTP / ddNTP = 100 / 1 （ 3）制備 2’和 3’雙脫氧的 ddNTP 時 , DNA電泳帶譜的分離效果最好，可讀出 200多個核苷酸序列。 需帶有 放射性或熒光標記 。 （ 4）制備一小段單鏈引物（ DNA或 RNA） 3. Sanger雙脫氧終止法測序過程 模板序列 1977年，哈佛大學(xué)的 . Maxam和 W. Gilbert發(fā)明。 (二 )、 MaxamGilbert化學(xué)修飾法 Walter Gilbert, 1980年 Nobel Prize化學(xué)獎 末端放射性標記 的 DNA片單鏈 長度只差一個核苷 酸的 DNA鏈混合物 化學(xué)試劑處理 凝膠電泳 放射性自顯影 閱讀堿基順序 特定的堿基中 引入化學(xué)基團 DNA在被修飾的 核苷酸位置斷裂 1. 原理 堿基 特異修飾方法 G ,用硫酸二甲脂對 N7進行甲基化，使 C8C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性 A+G ,哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的 N原子化，從而導(dǎo)致脫嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵 C+T 肼可打開嘧啶環(huán)，后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易于除去 C 在 ，可用肼除去胞嘧啶 2. 堿基特異的化學(xué)修飾法 反應(yīng) 切割 堿基修飾 修飾堿基的轉(zhuǎn)移 DNA鏈的斷裂 R1 GA 硫酸二甲脂 氫氧化鈉 R2 AG 硫酸二甲脂 酸 氫氧化鈉 R3 C+T 肼 六氫吡啶 六氫吡啶 R4 C 肼 +鹽 六氫吡啶 六氫吡啶 R5 G 硫酸二甲脂 六氫吡啶 六氫吡啶 R6 G+A 酸 酸 六氫吡啶 R7 C+T 肼 六氫吡啶 六氫吡啶 R8 C 肼 +鹽 六氫吡啶 六氫吡啶 R9 AC 氫氧化鈉 六氫吡啶 六氫吡啶 R10 GA 硫酸二甲脂 六氫吡啶 R11 G 亞甲藍 六氫吡啶 六氫吡啶 R12 T 四氧化鋨 六氫吡啶 六氫吡啶 3. 堿基特異的化學(xué)切割法 4. 測序過程 每組反應(yīng)只針對特定的堿基，共有 4組反應(yīng)，可分別顯示 G、 A+G、 C、 C+T的終止位置。 特點： 讀出的序列就是要測的序列。 Sanger測序法讀出的序列是 新合成 的互補鏈序列。 測序讀片 90年代初期由英國、前南斯拉夫和俄羅斯的 4個科學(xué)家小組同時提出來的。 1. 原理 （ 1）只有完全互補的 DNA序列才能雜交形 成完全的雙鏈分子。雜交效率最高。 (三 )、 DNA雜交測序 （ 2）有個別不互補堿基時，雜交效率下降。 （ 3）非互補堿基越多，雜交效率越差。 （ 4）用一段寡居聚苷酸（ 8mer）的 所有可能的堿基排列序列 作探針。 8mer探針有 48= 65536 種序列。 如： 8mer靶 DNA 同 65536中的 一種 探針完全雜交形成 完全互補 雙鏈。 （ 5）根據(jù) 雜交效率 可推斷出靶 DNA的序列。 5’AGCCTAGC3’ Target 3’TCGGATCG5’ Probe 假如探針序列已知，則可推知靶 DNA序列。 （ 4）用一段寡居聚苷酸（ 8mer）的 所有可能的堿基排列序列 作探針。 8mer探針有 48= 65536 種序列。 如： 8mer靶 DNA 同 65536中的 一種 探針完全雜交形成 完全互補 雙鏈。 （ 5）根據(jù) 雜交效率 可推斷出靶 DNA的序列。 5’AGCCTAGC3’ Target 3’TCGGATCG5’ Probe 假如探針序列已知，則可推知靶 DNA序列。 （ 1） DNA芯片（ chip） 把寡聚核苷酸探針的 3 ’端或 5’端與玻璃或凝膠形成共價連接。 目前可以做出 65536 種 8mer探針芯片。 2. 技術(shù)要點 每種探針的序列和位置已知，可被電腦讀出。 DNA chip 雜交 （ 1）非放射性標記 1981年第一臺商業(yè)化生產(chǎn)的 DNA自動測序儀誕生。 (四 )、 DNA自動化測序 熒光物質(zhì)標記。用激光能激發(fā)出 不同顏色的熒光。 1. 技術(shù)要點 （ 2）不同的標記對象 既可標記 引物 ，也可標記 ddNTP。 （ 4）分析自動化 （ 3）讀片的自動化 激光探頭直接讀膠，實時閱讀。 （ 2）反應(yīng)的自動化 Sanger脫氧終止法。 電腦自動把熒光信號轉(zhuǎn)化成對應(yīng)的堿基，并打印出 DNA序列。 （ 5）反應(yīng)可在一個試管中進行 標記 ddNTP時。 2. 熒光標記引物的自動化測序 ① 分別用 4種熒光物標記 引物 ， ② 區(qū)分反應(yīng)產(chǎn)物， ③ 混合 電泳， ④ 激光一次 讀膠， ⑤ 電腦 合成結(jié)果。 3. 熒光標記 ddNTP自動測序原理圖解 4種不同的熒光物分別標記 4種 ddNTP。 可在同一管中進行 可在單一泳道電泳。 測序結(jié)果 高通量 DNA序列分析技術(shù) ? 人類基因組計劃的成功很大程度上得益于有效減少 DNA測序成本的技術(shù)更新。通過改良測序方法，不斷提升其自動化程度， DNA測序的成本降低了100倍，從 20世紀 7080年代 $10/bp降低到本世紀初$！ ? 如果一個熟練的 DNA序列分析人員采取早期 80年代方法每天測定 1000 bp計算，人類基因組（約3 109bp）的全序列分析，至少也得需要 100名這樣的工人花上 100年的時間才能完成。而 2022年代的高通量測序儀可達到月測序 16 Mbp！ Illumina / Solexa Geic Analyzer 2022 Mb / run Applied Biosystems ABI 3730XL 1 Mb / day Roche / 454 Genome Sequencer FLX 100 Mb / run Applied Biosystems SOLiD 3000 Mb / run 高通量 DNA序列分析技術(shù)