【正文】 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇 25∶ 24 ∶ 1 1次 氯仿 ∶ 異戊醇 24 ∶ 1 1次 （ 5）除去 RNA污染 用 RNase。 二、用無菌 TE或雙蒸水做對照，將紫外分光光度計 260 nm、 280nm、 310nm調(diào)到零點。 是一種 線性多糖聚合物 ，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。 2. 原理 UVP全自動凝膠成像分析系統(tǒng) OMEGA8LOGO全自動凝膠成像分析系統(tǒng) （五）、聚丙烯酰胺凝膠銀鹽染色法 銀鹽染色法靈敏度比 EB高 200倍 .但銀染色后， DNA不宜回收。 3. 基因組進(jìn)化擴(kuò)增 4. 基因工程擴(kuò)增 載體 攜帶目的基因在寄主細(xì)胞中大量復(fù)制。 （ 2）第二步 循環(huán)（ circle） 94 ℃ 下 1分鐘，新合成的 DNA雙鏈又變性成單鏈模板。 （ 1） Taq DNA聚合酶 5. 影響 PCR的因素 Taq DNA聚合酶的最大特點是 熱穩(wěn)定性 ，耐高溫，非常適合 PCR過程的反復(fù)高溫變性要求。 一般引物設(shè)計為長 15— 30bp。 引物設(shè)計現(xiàn)在多用 專業(yè)軟件 ⑧ 套嵌引物（ nested primers) 1 3 2 4 如 Primer 但不能有 蛋白質(zhì)變性劑 、 DNA酶 、 Mg2+的螯合劑 等影響 DNA聚合酶的活性。 template template 3’ 5’ 5’ 3’ （傳統(tǒng) PCR只擴(kuò)增兩個引物質(zhì)之間的已知序列）。 （ 2）基因的體外誘變 技術(shù)關(guān)鍵： 利用引物的 5‘端序列不要求與模板嚴(yán)格配對，設(shè)計引物時引入突變序列。 （ 2）特殊的 DNA多聚酶 dNTP / ddNTP = 100 / 1 （ 3）制備 2’和 3’雙脫氧的 ddNTP 時 , DNA電泳帶譜的分離效果最好，可讀出 200多個核苷酸序列。 （ 4）用一段寡居聚苷酸（ 8mer）的 所有可能的堿基排列序列 作探針。 2. 熒光標(biāo)記引物的自動化測序 ① 分別用 4種熒光物標(biāo)記 引物 ， ② 區(qū)分反應(yīng)產(chǎn)物， ③ 混合 電泳， ④ 激光一次 讀膠， ⑤ 電腦 合成結(jié)果。 （ 4）分析自動化 （ 3）讀片的自動化 激光探頭直接讀膠，實時閱讀。 8mer探針有 48= 65536 種序列。 （ 3）復(fù)制反應(yīng)可以在 體外 進(jìn)行。 P1 P3 P4 P2 （ 6）原位 PCR(insitu PCR) 原位 PCR是 Hasse等于 1990年建立的技術(shù)，就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行 PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的 PCR技術(shù)的優(yōu)點，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項有較大潛力的新技術(shù)。 Real— time PCR（或 TaqMan PCR ） Ct值： 樣品到達(dá) 閾 值水平所經(jīng)歷的 循環(huán)數(shù)。 需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個或幾個堿基差異。 Taq的 PCR產(chǎn)物 3’端往往帶有一個 A。 （ 3）快速 整個 PCR過程約 4小時即可完成。 （ 2） DNA模板與引物復(fù)性 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ 3’ ACGTACGTA 5’ 3’ 引物 引物 引物（ primer） : 4065℃ DNA聚合酶按堿基配對原則在模板上延伸 DNA鏈。 在發(fā)育的某個階段，某些基因的大量擴(kuò)增。 聚丙烯酰胺凝膠濃度（ %） 分離 DNA片斷大?。?bp） 1000— 100 500— 25 50— 1 （三） 、聚丙烯酰胺凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳：分離 300— 50000bp 聚丙烯酰胺凝膠電泳：分離 1— 1000bp （四）、凝膠染色 1. 染料 溴化乙錠。 形狀相似的分子的遷移速度主要與 分子量相關(guān) : 分子量越大，移動越慢。 （可以加入 1/10體積的 3M醋酸氨輔助沉淀） 。 50 ℃ 溫育。 第一步：溶菌 50mM葡萄糖， 25mM TrisHCl()， 10mM EDTA， 45mg/ml溶菌酶 ， RNase A 溶液 II 破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和 DNA變性。 SDS: 溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成 “ 蛋白 — SDS”復(fù)合物 ，使蛋白質(zhì)（包括 DNA酶）變性沉淀。 ② 葡萄糖 增加溶液的 粘度 ，維持 滲透壓 ，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。 （現(xiàn)多用各種商品化的 層析柱 純化 DNA)。 苯酚 2次 酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇 25∶ 24 ∶ 1 1次 氯仿 ∶ 異戊醇 24 ∶ 1 1次 一般過程及原理： 動物組織剪成小塊，置 液氮 中凍結(jié)后 研磨 成細(xì)粉末。 用 異丙醇 （ 20 ℃ ）。 2. 電泳遷移率同電場的 強度 和分子本身所帶的 凈電荷數(shù)目 成 正比 。 （ 5）電壓。 四 基因擴(kuò)增技術(shù) PCR (一 )、基因擴(kuò)增（ gene amplification) 指生物體內(nèi)或體外人工方式使基因 拷貝數(shù)大規(guī)模增加 。 1986年 . Erilish從 嗜熱 水生菌分離出 耐高溫 的 Taq DNA聚合酶，代替大腸桿菌 DNA聚合酶 Klenow片段（ 37 ℃ )， PCR技術(shù)才進(jìn)入實用階段。提高了反映的特異性。 ③ Pfu DNA Polymerase ④ Taq Plus DNA Polymerase 有 3 ’5’的外切酶活性， 5’3’外切酶活性。 實際復(fù)性溫度選擇 低于 Tm值 5 ℃ 。 一般用 。 RNA template 3’ 5’ 下游引物 cDNA first strand 3’ 5’ 上游引物 cDNA first strand cDNA second strand 3’ 5’ 3’ 5’ 反轉(zhuǎn)錄酶 Taq酶 PCR Reverse transcription (RT) 下游引物 上游引物 Taq酶 (5)巢式 PCR（ NestPCR） 巢式 PCR的使用降低了擴(kuò)增多個靶位點的可能性，因為同多套引物都互補的靶序列很少。 Sanger等 1977年發(fā)明。 (三 )、 DNA雜交測序 （ 2）有個別不互補堿基時，雜交效率下降。 (四 )、 DNA自動化測序 熒光物質(zhì)標(biāo)記。 測序結(jié)果 高通量 DNA序列分析技術(shù) ? 人類基因組計劃的成功很大程度上得益于有效減少 DNA測序成本的技術(shù)更新。 （ 5）根據(jù) 雜交效率 可推斷出靶 DNA的序列。 (二 )、 MaxamGilbert化學(xué)修飾法 Walter Gilbert, 1980年 Nobel Prize化學(xué)獎 末端放射性標(biāo)記 的 DNA片單鏈 長度只差一個核苷 酸的 DNA鏈混合物 化學(xué)試劑處理 凝膠電泳 放射性自顯影 閱讀堿基順序 特定的堿基中 引入化學(xué)基團(tuán) DNA在被修飾的 核苷酸位置斷裂 1. 原理 堿基 特異修飾方法 G ,用硫酸二甲脂對 N7進(jìn)行甲基化，使 C8C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性 A+G ,哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的 N原子化，從而導(dǎo)致脫嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵 C+T 肼可打開嘧啶環(huán)，后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易于除去 C 在 ，可用肼除去胞嘧啶 2. 堿基