基因工程的理論基礎(chǔ)與基本技術(shù)-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 沉淀） 一般過程及原理： （ 1）組織粉碎 用 液氮 冷凍后 研磨 成細(xì)粉末。 CTAB即十六烷基三甲基溴化銨，是一種 陽(yáng)離子去污劑 ，在高離子強(qiáng)度的溶液里， CTAB與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多聚糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。 （ 3）純化 DNA 用苯酚和酚 氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。 用微量比色杯（ 10?l）在紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定。 四、計(jì)算 DNA濃度 ssDNA： [ssDNA]=33 （ OD260— OD310） 稀釋倍數(shù) dsDNA： [dsDNA]=50 （ OD260— OD310） 稀釋倍數(shù) ssRNA： [ssRNA]=40 （ OD260— OD310） 稀釋倍數(shù) 衡量提取 DNA 的純度 OD260/OD280 ＞ 可能有 RNA污染 OD260/OD280 ＜ 可能有蛋白質(zhì)污染 再進(jìn)行酶消化處理，酚氯仿抽提去酶 溴化乙錠（ EB）能插入 DNA分子中，紫外光照射下能發(fā) 紅色熒光 。如 ?DNA的 HindⅢ 酶切物等。 3. 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的 摩擦系數(shù) 成反比 。 5. Relaxed supercoiled Increasing degree of supercoiling 相同分子量的 DNA: 閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快， 線性分子次之， 伸展開環(huán)狀最慢。 濃度高 空隙小 瓊脂糖的濃度（ %） 分離 DNA的片斷大?。?bp） 50000— 1000 20220— 1000 6000— 300 空隙小，分辨率高： 小分子較易通過，而大分子難通過； 空隙大，分辨率低： 大小分子幾乎以同等速率通過。 （ 2） DNA的構(gòu)象。 （ 6）電泳緩沖液的成分及濃度。 EB在 300nm紫外光照射下能 發(fā)紅色熒光 ，即可顯示 DNA泳帶在凝膠中所處的位置。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色。 Southern blot 篩選結(jié)果 （二）、 Northern blot 用 DNA（或RNA）探針檢測(cè) RNA樣品 。有下列五種方式： 1. 環(huán)境誘發(fā)擴(kuò)增 2. 基因的程序性擴(kuò)增 5. PCR擴(kuò)增 3. 基因組進(jìn)化擴(kuò)增 4. 基因工程擴(kuò)增 1. 環(huán)境誘發(fā)擴(kuò)增 如氨甲喋呤誘發(fā)二氫葉酸還原酶基因擴(kuò)增。 生物進(jìn)化過程中基因組中某些基因的拷貝數(shù)增加，結(jié)果相關(guān)的 基因聚集成簇 。 當(dāng)時(shí)由于 引物 和 DNA聚合酶 及 DNA測(cè)序 技術(shù)都沒有解決，設(shè)想未能實(shí)現(xiàn)。 （ 3） Taq DNA 聚合酶 1988年 . Saiki 把 Taq DNA聚合酶用到 PCR反應(yīng)中。 PCR儀 2. PCR技術(shù)的原理 模板 DNA變性 引物 DNA復(fù)性 引物 DNA延伸 雙鏈 DNA在 受熱 后，配對(duì)堿基的氫鍵斷裂，DNA兩條鏈分開成為 單鏈 。 變性 — 復(fù)性 — 延伸。 ③ 延伸（ extend） ② 復(fù)性（ anneal） 5060 ℃ 下 1分鐘，引物優(yōu)先與模板復(fù)性。 4. PCR的特點(diǎn) （ 1）特異性強(qiáng) ① PCR使用專門合成的 DNA引物 。 理論上只要一條模板鏈， 32次循環(huán)就可合成約 109條！ RTPCR： 對(duì)模板的純度要求低。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。 因此不能修復(fù)錯(cuò)誤的堿基配對(duì)！ 合成超過 600bp長(zhǎng)度的 DNA就有可能出現(xiàn)錯(cuò)配，用于克隆基因時(shí)必須測(cè)序。 （ 2）其它耐熱的 DNA聚合酶 ① Tth DNA聚合酶 無(wú) 3’ ? 5’DNA外切酶活性，但高溫下能逆轉(zhuǎn)錄 cDNA，又能擴(kuò)增 DNA。 但 PCR產(chǎn)物為平端！ 是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫 DNA 聚合酶中出錯(cuò)率最低的。 （ 3）引物（ primer) ① 位置 3’ 3’ 即 ?1011 bp的基因組中有一次完全與 19個(gè)核苷酸的序列相同的機(jī)會(huì)（或機(jī)會(huì)是約 2 1011）。 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’ 3’GCTAGCTACTTAAG5’ 3‘端必須與模板正確配對(duì)， 5’端可以不配對(duì)。 5） 為了便于后續(xù)的克隆可以在 5`端加保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)。 手工計(jì)算： 一般估計(jì)： ⑥ 引物的濃度 一般使用終濃度各 ?mol/L。 設(shè)計(jì) 多組引物 ，結(jié)合位點(diǎn)依次位于前一組引物之間。 ① 純度： PCR對(duì)模板 DNA的純度要求不高。 Taq DNA聚合酶要求有游離的 Mg2+ 。 標(biāo)準(zhǔn)的 PCR反應(yīng)體系 引物 各 4種 dNTP 各 200umol/L 10 buffer 10ul 模板 DNA ～ 2ug ～ Taq酶 Mg2+ ddH2O 加至 100ul 加至 25ul 100ul 25ul 6. PCR技術(shù)的延伸技術(shù) （ 1）熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 常規(guī) PCR 電泳鑒定產(chǎn)物的量 缺憾 1 無(wú)法對(duì)初始模板精確定量 2 無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增情況 3 跑膠繁瑣、易污染 借助于 熒光信號(hào) 來(lái)檢測(cè) PCR產(chǎn)物。 ? C(t)值 ：熒光信號(hào)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。 低濃度的引物（限制引物）首先被用完，隨后只有高濃度的引物，繼續(xù)合成單鏈 DNA。 擴(kuò)增 RNA模板。 巢式 PCR可以增加有限量靶序列（如稀有 mRNA）的靈敏度，并且提高了困難 PCR（如 539。 （ 7）錨定 PCR（ anchored PCR） 錨定 PCR：擴(kuò)增已知序列側(cè)翼未知序列的一種PCR方法，未知的 3’端添加一同聚物尾（ polyG)，以互補(bǔ)的同聚物引物（ polyC)和按已知序列設(shè)計(jì)的引物一起作 PCR擴(kuò)增。 （ 3）基因組的比較研究 比較不同物種之間的基因組特征和相似性。 2. 當(dāng)時(shí)的分析思路局限于 RNA序列分析法。 (一 )、雙脫氧鏈終止法 Frederick Sanger, 1980年 Nobel Prize化學(xué)獎(jiǎng) （ 1） DNA復(fù)制是以一條鏈為模板，按 堿基配 對(duì) 的原則進(jìn)行的。 1. 原理 （ 1）制備單鏈 DNA模板 2. 技術(shù)要點(diǎn) 就是待測(cè)序的 DNA鏈。 （ 4）制備一小段單鏈引物（ DNA或 RNA） 3. Sanger雙脫氧終止法測(cè)序過程 模板序列 1977年，哈佛大學(xué)的 . Maxam和 W. Gilbert發(fā)明。 測(cè)序讀片 90年代初期由英國(guó)、前南斯拉夫和俄羅斯的 4個(gè)科學(xué)家小組同時(shí)提出來(lái)的。 （ 3）非互補(bǔ)堿基越多，雜交效率越差。 （ 5）根據(jù) 雜交效率 可推斷出靶 DNA的序列。 如： 8mer靶 DNA 同 65536中的 一種 探針完全雜交形成 完全互補(bǔ) 雙鏈。 目前可以做出 65536 種 8mer探針芯片。用激光能激發(fā)出 不同顏色的熒光。 電腦自動(dòng)把熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的堿基，并打印出 DNA序列。 可在同一管中進(jìn)行 可在單一泳道電
高考資料相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1