【正文】 。 ② VENT DNA聚合酶 有 3‘?5’外切酶活性，能夠校正堿基的錯(cuò)配。 金屬離子敏感（尤其是 Mg2+ ）。 自從 . Erilish分離出耐高溫的 Taq DNA聚合酶，代替大腸桿菌 DNA聚合酶 Klenow片斷（ 37 ℃ )， PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。 （ 5）可以擴(kuò)增 mRNA （ 4）簡便 先用 逆轉(zhuǎn)錄酶 將 mRNA合成 cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。 ② 延伸過程是在 高溫 下進(jìn)行。 ① 引物的濃度高 ② 引物的鏈短。 （ 5） 1個(gè)循環(huán)的結(jié)果 （ 4）新一輪循環(huán)開始 3. PCR的過程 （ 1）第一步 預(yù) 變性（ denature） 9495 ℃ 下 5分鐘，模板 DNA雙鏈完全變性成單鏈。 TGCATGCAT ATCTTGAAC TAGAACTTG ACGTACGTA TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ TAGAACTTG ACGTACGTA 95℃ （ 1） DNA模板變性 模板 模板（ template） 95℃ TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ TAGAACTTG ACGTACGTA 3’ 人工合成的單鏈 DNA小片段，堿基順序分別與所要擴(kuò)增的模板 DNA雙鏈的 5’端相同 。使 PCR自動(dòng)循環(huán)儀成為可能。 Polymerase Chain Reaction 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ Polymerase Chain Reaction）技術(shù)是利用酶促反應(yīng)在體外指導(dǎo)特定 DNA序列擴(kuò)增的方法，以熱變性的雙鏈 DNA分子為模板，利用引物和四種脫氧核苷三磷酸（ dNTPs）為原料在 DNA聚合酶的作用下大量擴(kuò)增了特定的 DNA片段。 5. PCR擴(kuò)增 應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ Polymerase Chain Reaction， PCR）技術(shù)，在體外特異性地?cái)U(kuò)增某個(gè)基因。 在環(huán)境因子的誘發(fā)下，某些基因產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增。 （三 )、 原位雜交 對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。 具體步驟 固定液固定： ml 95%乙醇、 ml冰醋酸定容到 500ml 染色液染色： 1克硝酸銀定容至 500ml 顯色液顯色： NaOH加 500ml DNADNA或 DNARNA鏈雜交。 熒光強(qiáng)度與 DNA含量及大小成正比。 何為電泳遷移率？影響 DNA瓊脂糖凝膠電泳遷移率的因素有哪些？ 優(yōu)點(diǎn)是比瓊脂糖凝膠的 分辨率高的多 。 （ 3）瓊脂糖濃度。 空隙大小決定其分辨分子大小的能力。 超螺旋 線性 開環(huán) （二 ） 、瓊脂糖凝膠電泳 1. 瓊脂糖 2. 瓊脂糖凝膠 瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“ 胨 ” 。 （一）、電泳的基本原理 4. 如果電場強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）： 分子在電場中遷移的速度主要取決于分子本身的 大小和形狀 。 （四）、 DNA分子量的估計(jì) Marker Marker DNA ladder 28kb 2500bp 2300bp 1300bp 900bp 750bp 200bp 5000bp 20kb 1000bp 900bp 800bp 700bp 600bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp DNA Marker 自從瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠被引進(jìn)核酸研究以來，凝膠電泳已經(jīng)發(fā)展成為一種分析重組 DNA分子的重要技術(shù)手段，同時(shí)也被廣泛地應(yīng)用于 DNA 的核酸內(nèi)切酶消化片段的分析、分離和純化以及蛋白質(zhì)的分析和純化等方面的工作。 2. 瓊脂糖凝膠電泳估計(jì) 原理： 與 已知濃度 的 DNA電泳帶熒光強(qiáng)度對(duì)比 ，就可以估計(jì)出 DNA含量。 原理： 蛋白質(zhì)在 280nm處有吸收峰 2 濃度測定步驟 一、用無菌 TE或雙蒸水將待測樣品稀釋 20倍或更高。 （ 4）沉淀 DNA （ 5）除去 RNA污染 用 RNase A。因此， CTAB可以用于從大量產(chǎn)生粘多糖的有機(jī)體如植物以及某些革蘭氏陰性菌（包括 ）中制備純化 DNA 。 3. 從植物組織中制備 DNA （ 2）細(xì)胞裂解 用 2%CTAB / 2ME (十六烷基三甲基溴化銨 /2巰基乙醇）。也是蛋白質(zhì)變性劑。 （ 1）組織粉碎 2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組 DNA的抽提 %SDS和 。 不用 NaOH ! （ 3）沉淀 DNA 。 （ 3）質(zhì)粒大小 分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。 一般要使用 endA基因 發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。 （ 3）堿抽提法提取質(zhì)粒 DNA的步驟 Solution I 的配制： 使用 “ 溶液 Ⅰ ”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。 蛋白變性劑 ，進(jìn)一步抽提 DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。 以免提取后的 DNA中含有小分子的 RNA。 高濃度的 NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、 DNA、 RNA等）沉淀。 ④ NaOHSDS NaOH：強(qiáng)堿，提供 pH12的堿性條件，使 DNA雙鏈 變性 。 變性 （ 2） 所用的試劑作用 ① 溶菌酶 能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分 肽聚糖 中的 ?1， 4糖苷鍵 。第二節(jié)基因工程的基本技術(shù) 有毒試劑 基因工程實(shí)驗(yàn)安全 溴化乙錠（ EB）： DEPC(焦碳酸二乙酯 ):強(qiáng)有力的蛋白質(zhì)變性劑 丙烯酰胺：有毒，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng) 過硫酸酸銨：對(duì)粘膜和上呼吸道、眼睛和皮膚有較大危害性，吸入可致命。 一 DNA的提取與純化 （一）、質(zhì)粒 DNA的提取 plasmid DNA The genomic DNA of E. coli: a single circular doublestranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell. Genomic DNA 閉合環(huán)狀的質(zhì)粒 DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快； （ 1） 原理 1 .堿抽提法提取質(zhì)粒 DNA DNA雙鏈 變性 DNA單鏈 復(fù)性 強(qiáng)堿 中性 染色體 線性 DNA和或 有缺口 的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì) — SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候 沉淀 下去。 ③ EDTA Mg2+、 Ca 2+的螯合劑，可抑制 DNA酶 的活性，防止 DNA被酶降解。 用來 中和 NaOH變性液，使 DNA復(fù)性。 ⑤ NaAcHAc緩沖液 ⑦ RNase A 降解 RNA。 TrisHCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖業(yè)），有利于以后操作； EDTA抑制 DNA酶，防止 DNA被酶降解。 ⑨ 酚 氯仿 選用 以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。 Solution III的配制： NaOH， %SDS 3M 醋酸鈉（用冰醋酸調(diào) pH至 ） 最重要的是： 2. 影響質(zhì)粒 DNA產(chǎn)量的因素 菌株的遺傳背景， 質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。 這是直接決定 DNA產(chǎn)量的重要因素之一。 37 ℃ 溫育。 組織培養(yǎng)的細(xì)胞用 胰酶 消化松散后直接使用。 SDS是離子型去垢劑（ detergent），可以使細(xì)胞膜崩解。 （ 4）沉淀 DNA （可以加入 1/10體積的 3M醋酸氨 輔助