【正文】 體中包含的是單連 +DNA。 M13 RF + + + 外源 DNA 轉(zhuǎn)染 E. coli 成熟的子代 M13 + + M13mp8 M13mp9 ① 插入外源 DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降 ② 實際克隆能力小于 1500bp。 雖無包裝限制，并非無限包裝！ 5. M13載體的缺點 由 質(zhì)粒載體 與 單鏈?zhǔn)删w載體 的復(fù)制起點結(jié)合而成的新型載體系列。 MCS 噬菌體 ori 質(zhì)粒 ori Ampr lacZ’ lacI 第六節(jié) 噬菌粒 載體 約 3000bp（比 M13小） ② 克隆能力大 能插入 10kb的外源 DNA。 ③ 兩種復(fù)制形式 ① 分子量小 （ 1）噬菌粒載體的特點 既具有質(zhì)粒的復(fù)制起點，又具有噬菌體的復(fù)制起點。 既能在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式雙鏈復(fù)制，又能如 M13噬菌體進(jìn)行單鏈復(fù)制。 （ 2）常見的噬菌粒載體 噬菌粒載體 質(zhì)粒 部分 單鏈?zhǔn)删w部分 輔助噬菌體 大腸桿菌寄主 pEMBL8 pUC8 f1 IR1 71/18 pRSA101 ?VX M13 M13變異株 XS127，XS101 pUC118/pUC119 pUC18/ pUC19 M13 M13K07 MV1184 pBS pUC f1 M13K07 XL1Blue 輔助噬菌體用來復(fù)制和包裝噬菌粒載體。 （ 3） pUC118/pUC119 ① 構(gòu)成 1） M13的基因間隔區(qū)（ IG） 2） pUC18/pUC19質(zhì)粒載體： 帶有 M13復(fù)制起點。 質(zhì)粒復(fù)制起點 Ampr lacZ’ MCS MCS pUC18/pUC19 ori Ampr lacZ’ lacI M13 ori pUC118/119 ② pUC118/119的復(fù)制模式 兩種不同的復(fù)制模式 1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式 受 pUC本身的復(fù)制起點（來源于 ColE1）的控制。 每個細(xì)胞能達(dá)到 500個拷貝。 來源于 M13的復(fù)制起點被 輔助噬菌體的基因 II產(chǎn)物控制。 2）單鏈滾環(huán)噬菌體復(fù)制模式 外殼蛋白 復(fù)制蛋白 輔助 M13 包裝 當(dāng)寄主細(xì)胞被 輔助噬菌體 M13感染后。 ③ 噬菌粒載體的包裝 1）輔助噬菌體： 自身的 復(fù)制起點發(fā)生了突變 ，復(fù)制效率低下，但感染細(xì)菌后能表達(dá)出 外殼蛋白和復(fù)制蛋白 ，幫助噬菌粒載體復(fù)制。 如 M13K07等。 2）包裝： 輔助噬菌體 外殼蛋白和 復(fù)制蛋白 噬菌粒載體 ssDNA 噬菌體 （ 4） pBluescript 噬菌粒載體（ pBS） Stratagene公司發(fā)展的一類噬菌粒載體。 由 pUC質(zhì)粒載體、 f1噬菌體的復(fù)制起點和T T7噬菌體的啟動子 組成。 ② 特點 ① 組成 MCS兩側(cè)分別加上 T3和 T7噬菌體的啟動子。加入適當(dāng)?shù)氖删w RNA聚合酶，就可以定向體外轉(zhuǎn)錄。 1）定向體外轉(zhuǎn)錄 2）兩種復(fù)制模式 既能以質(zhì)粒的形式復(fù)制，又能以噬菌體的形式復(fù)制包裝。 3）選擇方便 有 Ampr和 lacZ’，可以進(jìn)行 Amp抗性選擇和 XgalIPTG藍(lán)白斑選擇。 4）插入方便 18個單一酶切位點的 MCS SK：表示 lacZ’的 轉(zhuǎn)錄方向 是沿 MCS上的 SacI ? KpnI +（ f1+）：單鏈 復(fù)制起始方向 背離 lacZ’， 能回收 lacZ’的編碼鏈（ +） pBluescript SK（ +/） /pBluescript KS（ +/） KS：反向（ KpnI ? SacI ， MCS相反） － （ f1－ ）：能回收 lacZ’的非編碼鏈（ － ） pBluescript SK/KS（ +/）區(qū)分： ③ 常用的 pBluescript 載體 pBS SK+ pBS KS （ 5） PCR產(chǎn)物克隆載體 T 載體 pCR系列載體 Invitrogen公司開發(fā)的 線性 噬菌粒載體。 ① 結(jié)構(gòu) pUC的質(zhì)粒部分、 fi噬菌體 ori、 Kanr和 Ampr抗性。 MCS的中部已經(jīng)切開，各有一個 3’端突出的 T。 ② 特點 PCR產(chǎn)物往往在 3’端突出一個 A，所以能與這個載體直接連接。 MCS 克隆的 PCR產(chǎn)物能被兩側(cè)的 EcoRI切下來回收 pGEMT vector T vector的克隆過程 ——簡便！ T vector PCR product T4 DNA ligase T TB 用于基因克隆的載體 3 基因工程的基本條件 質(zhì)粒（ plasmid） 噬菌體載體 考斯質(zhì)粒（ cosmid）與噬菌粒 人造染色體載體 載體的功能及特征 第七節(jié) 人工染色體克隆 載體 將細(xì)菌接合因子和酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成 染色體載體 。當(dāng)大片段的外源 DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。 目前常用的人造染色體載體包括： ?細(xì)菌人造染色體（ BAC） ?酵母人造染色體（ YAC） 1983年形成基礎(chǔ)理論 1987年將其變?yōu)楝F(xiàn)實 一、酵母人工染色體 1. YAC的特點： （ 1）不作為質(zhì)粒使用時，只能在酵母細(xì)胞中擴(kuò)增。 （ yeast artificial chromosome, YAC) （ 2）克隆容量大，為 230kb1700kb。 （ 3）構(gòu)建原理，按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建。 （ 1） DNA復(fù)制起始點（ ori） 2. 染色體復(fù)制和遺傳的三個基本組件： TEL TEL CEN ORI （ 2）著絲粒（ centromere， cen） （ 3）兩個端粒（ telomeres， tel） Leu Leu Yeast 后代死 Leu Yeast 80%后代死 Leu Yeast 后代活 Leu Yeast 后代死 Leu Yeast 后代活 Tel Tel （ 1）著絲粒區(qū)（ CEN） A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA 3. YAC的組成結(jié)構(gòu) 酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列 : 7886bpAT I II III 由三個區(qū)組成 酵母第 11號染色體的著絲粒區(qū)序列： 酵母 端粒保守序列 是 (G4T2)n 重復(fù)序列 （ 3）復(fù)制起點（ ORI） 約 100bp的自主復(fù)制序列（ ARS） （ 2）端粒（ TEL） 人是 TTAGGG重復(fù)序列 。 四膜蟲是 GGGTTG重復(fù)序列 兩個端粒序列 Tel 位于 SUP4 基因內(nèi)部。 （ 4）克隆位點 插入失活選擇： SUP4酶失活的酵母菌落呈 紅色； 不失活的菌落是白色。 TRP URA3（分別位于兩臂）。 細(xì)菌的復(fù)制起點 ori和抗生素標(biāo)記Ampr （ 5）在酵母中的標(biāo)記基因 （ 6）在細(xì)菌中操作 URA3 TRP1 CEN4 4. YAC克隆外源 DNA （ 1）宿主酵母菌： 只有同時得到 YAC的 兩個臂 ，才能在基本培養(yǎng)基（不加 TRP和 URA）上生長。 （ 2）選擇方式 5. YAC轉(zhuǎn)化過程 trp 和 ura cen ura3 trp1 （ 1）存在插入子的穩(wěn)定性問題 6. YAC的缺點： （ 2）同一酵母細(xì)胞內(nèi)多個 YAC引起交換 （ 3）轉(zhuǎn)化效率低 （ 4）難以制備純的 YACDNA H. Shizuya等 1992年在大腸桿菌 F因子的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。 （ 2）克隆容量可達(dá) 300kb 二、細(xì)菌人工染色體（ BAC） 1. F質(zhì)粒的特點： 每細(xì)胞只有一個拷貝，不會重組。 （ 4）便于提純 如提取質(zhì)粒一樣直接提純。 （ 1）單拷貝復(fù)制 （ 3）比較穩(wěn)定 （ 1） OriS和 repE控制質(zhì)粒的單向復(fù)制。 （ 2） parA和 parB維持低水平質(zhì)粒拷貝數(shù)。 2. BAC的組成結(jié)構(gòu) （ 3） CosN是噬菌體末端酶專一性切割位點。 （ 4） loxP是 P1 Cre蛋白作用位點。 （ 5） HindIII和 BamHI是插入位點。 （ 6）兩側(cè)的 NotI可用于切下外源 DNA。 （ 7）氯霉素抗性基因 CMR BAC 三、人工染色體克隆載體的應(yīng)用 （ 1）構(gòu)建基因組文庫 （ 2）基因治療 （ 3）基因功能鑒定