基因工程第五章載體-資料下載頁
2025-09-11 20:46本頁面
【正文】 能區(qū)保證質?？截惐黄骄峙?。 ? 人工構建的質粒這個功能區(qū)已經缺失，因此，它在細胞分裂中是隨機分配的，盡管出現(xiàn)無質粒的細胞的幾率較低，但在一定的條件下，比如 ―― －細胞分裂較快或營養(yǎng)缺乏的情況下，會出現(xiàn)無質粒的細胞。 解決辦法：施加選擇性壓力（抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)）。 ? 結構的不穩(wěn)定性：質粒分子帶有外源基因，外源基因有時會與宿主 DNA進行同源重組，另外，一些誘變作用會產生外源 DNA的缺失、插入、重排，再有寄主染色體的轉座子也會使基因插入失活。這些因素會引起質粒的結構不穩(wěn)定。 解決辦法：功能性基因突變 Vector of ? phage Section two ?1974年， Davis發(fā)現(xiàn) ?噬菌體失去一部分 DNA后，仍然不失活，這一部分缺失 DNA的空間正好用來承載外源基因片斷，第一次證明了 ?噬菌體 DNA作為基因無性繁殖載體的可能性。 ??噬菌體載體和外源基因重組后，可以隨寄主細胞一道復制和增值，在溶源周期，可整合到宿主染色體上，這是 ?噬菌體載體作為基因工程載體的以發(fā)展重要特征。 一、 ?噬菌體的 DNA結構特征： ??噬菌體的基因組是一條線性 DNA， DNA分子兩端各有一個由 12個核苷酸組成的互補的 5‘突出的黏性末端，所以，這種線性分子可以發(fā)生環(huán)化，形成閉合的環(huán)狀分子，這個位點成為 cos 位點，即黏性末端。 ?環(huán)化狀態(tài)下， ?噬菌體 DNA分子的長度是 48502bp, 定位著 61個與噬菌體生活相關的基因，這些基因聚集成促，控制著噬菌體頭、維、復制、重組四大功能。 二、 噬菌體載體的構建： 野生 ?噬菌體 DNA不適于用作基因克隆，改造集中于兩個方面： ? 消除多余的限制性內切酶切割位點： ?噬菌體 DNA作為載體來說，突出的缺點是對大多數(shù)常用的核酸限制性內切酶都具有過多的限制性切點，而其中有的切點在基因組的必要區(qū)。所以我們要對它進行改造，改造可通過點突變，序列置換及缺失。 ? 去除 ?噬菌體 DNA中的非必要區(qū)： ? 經過測定， ?噬菌體 DNA中有一半參加噬菌體的生命活動，即有 50％的基因對噬菌體的生長和噬菌斑的形成是必須的。而另一部分基因當他們被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能。因此，可以利用置換和缺失去除 ?噬菌體 DNA中一些非必要區(qū)，使他能拼接不同長度的外源 DNA片斷。 ? ?噬菌體載體有一個系列，分別可容納 9－ 22kb的片斷。（ ?噬菌體裝配的要求是重組的 DNA分子要保證在 ――50kb 才能進行裝配），所以對于大片斷不能采用 ?噬菌體載體。 三、 ?噬菌體載體的作用： ? ?噬菌體侵染宿主后，有兩個途徑： 溶源途徑：當 DNA進入宿主細胞后，整合到染色體上，隨著宿主染色體復制而復制。 裂解途徑：當 DNA進入宿主細胞后，形成環(huán)狀 DNA，進行滾環(huán)復制，并合成頭 /尾。然后切割，包裝、釋放。溶源性在特殊的條件下可實現(xiàn)向裂解途徑的轉變。 ? 我們可以以噬菌體 DNA作為載體，通過外源基因體外重組、病毒的體外包裝（有試劑盒），制造出成熟的含有外源基因的病毒顆粒，去感染大腸桿菌，發(fā)生溶源性結合，然后通過大腸桿菌的增殖使含有外源基因的大腸桿菌的數(shù)量不斷增加，同時采用選擇性壓力富集含有外源基因的菌株，（可不講 :最后通過特殊條件誘導，溶源途徑轉變?yōu)榱呀馔緩?，噬菌體大量繁殖，產生噬菌斑，通過雜交進行目的基因檢測。）
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