【正文】 pr, Kanr BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, PstI, SmaI 32~45 pHC79 pMB1 Ampr , Tetr EcoRI, HindIII, SalI, BamHI, PstI, CalI 29~46 pHS262 ColE1 Kanr BamHI, EcoRI, HincII 34~50 pJC74 ColE1 Ampr EcoRI, BamHI, BglII, SalI 21~37 pJC7558 ColE1 Ampr EcoRI, BamHI, BglII 16~42 pJC74m ColE1 21 Ampr, Kanr BamHI 16~32 pJC720 ColE1 Elimm, Rifr HindIII, XmaI 11~28 178 Cosmid 載體 復(fù)制子 大?。?kb) 選擇標(biāo)記 克隆位點(diǎn) 克隆能力（ kb) pJC81 pMB1 Ampr, Tetr KpnI,BamHI,HindIII,SalI 30~46 pJB8 ColE1 Ampr BamHI,HindIII,SalI 31~47 MuA3 pMB1 Tetr PstI,EcoRI,BalI,PvuI, PvuII 32~48 MuA10 pMB1 Tetr EcoRI,BalI,PvuI,PvuI 32~48 pTL5 pMB1 Tetr BglII,BalI,HpaI 31~47 pMF7 pMB1 Ampr EcoRI,SalI 32~48 179 應(yīng)用 cosmid載體在大腸桿菌中克隆大片端的真核基因組 DNA技術(shù)，叫 “ 柯斯克隆 ” （ cosmid cloning）。 （ 5） cosmid cloning ① 理論依據(jù)： cos位點(diǎn) : ?噬菌體的生命周期中，會(huì)產(chǎn)生數(shù)百個(gè)?DNA通過 cos位點(diǎn)連接的 “ 多聯(lián)體 ” 分子。 “多聯(lián)體 ” 復(fù)制： 包裝識(shí)別。 180 在包裝的時(shí)候， ?噬菌體具有位點(diǎn)特異的 末端酶（ terminase）體系 （ Ter體系），識(shí)別 cos位點(diǎn)，把多聯(lián)體切成單個(gè) ?DNA長度。 兩個(gè) cos位點(diǎn)之間，必須保持 38—45kb的 DNA， Ter體系才能識(shí)別。 Ter體系： 包裝限制： 181 ① 用特定的核酸內(nèi)切酶消化真核生物 DNA。 （ 6） cosmid克隆的一般過程 ② 用同樣的內(nèi)切酶消化 cosmid載體。 產(chǎn)物中將有一定比例的分子是兩端各有一個(gè) cos位點(diǎn)、長度 40kb左右的真核 DNA與載體的連接物。 ③ 連接 182 切割 合適長度 的雜種 DNA連接物，并包裝入噬菌體頭部。 注入到細(xì)菌體內(nèi)的雜種 DNA分子環(huán)化，并按質(zhì)粒的方式復(fù)制。 ⑤ 感染大腸桿菌 ④ Ter體系識(shí)別并切割 183 184 185 Digestion Ligation C) Packaging and infect Formation of a cosmid clone 186 187 大質(zhì)粒！ 188 ① 載體片斷自我連接。 ② 外源 DNA片斷自我連接。 ③ 多個(gè)本來不在一起的外源 DNA片斷連接起來同時(shí)插入載體。 （ 7） cosmid載體克隆的缺點(diǎn) 用 堿性磷酸酶 除去線性質(zhì)粒片斷 5’端的磷酸，可防止載體自體連接。 克服載體自體連接的改良方案： 189 第三節(jié) 大分子 DNA克隆載體 1983年形成基礎(chǔ)理論 , 1987年變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。 一、酵母人工染色體 1. YAC的特點(diǎn)： （ 1）只能在酵母細(xì)胞中擴(kuò)增。 （ yeast artificial chromosome, YAC) （ 2）克隆容量大，為 230kb1700kb。 （ 3）構(gòu)建原理：按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建。 190 （ 1） DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ ori） 2. 染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件： TEL TEL CEN ORI （ 2）著絲粒（ centromere， cen） （ 3）兩個(gè)端粒（ telomeres， tel） 191 （ 1）著絲粒區(qū)（ CEN） A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA 3. YAC的組成結(jié)構(gòu) 酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列 7886bp I II III 由三個(gè)區(qū)組成 193 酵母第 11號(hào)染色體的著絲粒區(qū)序列： 194 酵母 端粒保守序列 是 (G4T2)n 重復(fù)序列。 （ 3）復(fù)制起點(diǎn)（ ORI） 約 100bp的自主復(fù)制序列（ ARS）。 （ 2）端粒（ TEL） 人是 TTAGGG重復(fù)序列 。 四膜蟲是 GGGTTG重復(fù)序列。 （真核生物中只有酵母菌有 ARS） 195 位于 SUP4 基因內(nèi)部。 （ 4）克隆位點(diǎn) 插入失活選擇： SUP4酶失活的酵母菌落呈 紅色 ； 不失活的菌落是白色。 196 TRP URA3（分別位于兩臂）。 細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn) ori和抗生素標(biāo)記Ampr （ 5）在酵母中的標(biāo)記基因 （ 6）在細(xì)菌中操作 197 4. YAC克隆外源 DNA URA3 TRP1 CEN4 198 （ 1）宿主酵母菌： 只有同時(shí)得到 YAC的 兩個(gè)臂 ，才能在基本培養(yǎng)基（不加 TRP和 URA）上生長。 （ 2）選擇方式 5. YAC轉(zhuǎn)化過程 trp 和 ura cen ura3 trp1 200 201 （ 1）存在插入子的穩(wěn)定性問題 6. YAC的缺點(diǎn)： （ 2）同一酵母細(xì)胞內(nèi)多個(gè) YAC引起交換 （ 3）轉(zhuǎn)化效率低 （ 4）難以制備純的 YACDNA 202 H. Shizuya等 1992年在大腸桿菌 F因子的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。 （ 2）克隆容量可達(dá) 300kb。 二、細(xì)菌人工染色體（ BAC） 1. F質(zhì)粒的特點(diǎn)： 每細(xì)胞只有一個(gè)拷貝，不會(huì)重組。 （ 4）便于提純。 像提取質(zhì)粒一樣直接提純。 （ 1）單拷貝復(fù)制。 （ 3）比較穩(wěn)定。 203 （ 1） OriS和 repE控制質(zhì)粒的單向復(fù)制。 （ 2） parA和 parB維持低水平質(zhì)粒拷貝數(shù)。 （ 3） CosN是噬菌體末端酶專一性切割位點(diǎn)。 （ 4） loxP是 P1 Cre蛋白作用位點(diǎn)。 （ 5） HindIII和 BamHI是插入位點(diǎn)。 （ 6）兩側(cè)的 NotI可用于切下外源 DNA。 （ 7）氯霉素抗性基因 CMR 2. BAC的組成結(jié)構(gòu) 204 第四節(jié) 病毒載體 一、反轉(zhuǎn)錄病毒載體 （ ritrovirus） 正鏈 RNA病毒，顯著特點(diǎn)是具有 2倍體基因組。 兩個(gè)相同的 RNA分子在 5’端附近經(jīng)氫鍵連接形成 70S RNA，這種結(jié)構(gòu)可能在逆轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)節(jié)作用。 205 反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu) 206 類似于真核細(xì)胞 mRNA 2. 反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu) env pol gag U3 U3 U5 U5 cap polyA 3’ 5’ LTR LTR R R ?+ Moloney murine leukemia virus (Moloney MLV) 長末端重復(fù)序列。在病毒基因組整合中至關(guān)重要。整合時(shí)，整合酶在 U5U3連接處切開雙鏈 DNA，隨機(jī)插入到宿主基因組里。 LTR本身還具有啟動(dòng)子和 polyA加尾信號(hào)的功能。 LTR： 208 ?+：組裝時(shí)必需的非編碼序列 。 env：外殼蛋白。 pol：反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。 gag：核心蛋白。 env pol gag U3 U3 U5 U5 cap polyA 3’ 5’ LTR LTR R R ?+ U U3： 5’段或 3’端獨(dú)特序列。 209 3. 反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建 （ 1）刪除 pol、 env和 gag基因。 5’LTR ?+ 外源基因 neor 3’LTR 啟動(dòng)子 （ 2）插入標(biāo)記基因（如 neor neor）。 （ 3）外源基因和啟動(dòng)子插入到 ?+下游。 210 二、 DNA病毒載體 腺病毒（ adenovirus） 1. 腺病毒的基因組 線狀雙鏈 DNA病毒，基因組中有 14個(gè)基因。 共同特點(diǎn)是都帶有倒置的末端重復(fù)（ ITR），在病毒的復(fù)制過程中起非常重要的作用。 211 （ 1）比較安全，無致病、致癌、致畸作用。 （ 2）宿主范圍廣 2. 腺病毒的 優(yōu)點(diǎn) 不僅能感染有分裂能力的細(xì)胞，也能感染不能分裂的細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）。 （ 4）載體中的插入片斷可達(dá) （有包裝容量限制）。 （ 5）腺病毒容易制備、純化。 （ 6）基因組結(jié)構(gòu)和功能了解得清楚。 （ 3）可以在呼吸道和腸道中繁殖， 可以通過口服或噴霧的方式感染。 212 3. 腺病毒載體 是目前最常用的基因治療載體之一。 （ 1）腺病毒載體的構(gòu)建 用 同源重組 的方法插入外源基因。 ① 刪除腺病毒 DNA一些非必需區(qū) ITR E1 ITR E3 如 E1或 E3區(qū)，增加插入能力。 E1或 E3缺失病毒。 213 含有 E1或 E3區(qū) 兩側(cè)的同源序列 。 在同源序列之間插入外源基因和選擇標(biāo)記基因。 ② 構(gòu)建質(zhì)粒載體 214 ③ 把質(zhì)粒切成線性 ④ 共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞 在細(xì)胞中發(fā)生同源重組，把外源 DNA加到病毒基因組中，并包裝成 重組病毒顆粒 。 質(zhì)粒與病毒DNA（缺失E1或 E3） 215 216 217 第五節(jié) 基因打靶載體（ Targeting vector） 通過 DNA同源重組，使細(xì)胞特定的內(nèi)源基因被破壞而造成其功能喪失或在基因組特定的位點(diǎn)插入外源基因。 一、基因打靶（ gene targeting） 基因敲出（ knockout） 基因敲入（ knockin） 218 二、基因打靶載體的要求 1. 要求能整合到染色體上特定的位置。 2. 整合的位置盡量選在基因組內(nèi)編碼非必需產(chǎn)物的地方。 3. 必須 整合在基因組中可以轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。 定點(diǎn)整合 219 1. 兩段同源 DNA序列（ HB1和 HB2） 2. 目的基因 三、基因打靶載體組成 3. 編碼抗 G418的基因（ neor） 4. 胸苷激酶基因（ HSVtk1和 HSVtk2） 與靶位點(diǎn)兩端的區(qū)域同源 新霉素（ neomycin）磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 分別來自 I型和 II型單純皰疹病毒（ HSV）。 載體 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 載體 220 四、載體的整合方式 染色體 DNA HB1 染色體 DNA HB2 染色體 DNA 載體 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 載體 染色體 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 染色體 兩個(gè) tk基因 至少有一個(gè) 可能整合到基因組里。細(xì)胞被 tk基因殺死 。 1. 非特異整合 —— 非同源重組 221 —— 同源重組 載體 tk1 HB1 neor 目的基因 HB2 tk2 載體 HB1 neor 目的基因 HB2 染色體 DNA HB1 染色體 DNA HB2 染色體 DNA 染色體 DNA 染色體 DNA 只有目的基因和 neor基因整合進(jìn)去， tk基因不會(huì)整合。 細(xì)胞在 G418中存活 。 222 五、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的選擇 正 負(fù)選擇法： 1. 正選擇（ positive selection）： 用 G418進(jìn)行選擇。 沒有整合進(jìn) neor基因的細(xì)胞都被殺死。 2. 負(fù)選擇（ negative selection）： 用 9鳥嘌呤 （ ganciclovir， GCV）。 表達(dá)胸苷激酶（ tk）的細(xì)胞都被殺死（ Tk能把 GCV轉(zhuǎn)化成有毒的化合物 ）。 223