【正文】 52 （ 2）長度 約 （ 3）克隆位點 10個連續(xù)的單一限制酶切位點，位于 lacZ’基因的 5’端。 使 EcoRI 也成為插入失活型位點。 （ 6） pBR322的缺點 能夠被 ColK質粒編碼的 mob蛋白識別，如果再有 F質粒的參與，就有可能轉移！ 48 ① 刪除 mob識別位點 （如質粒 pBR32 pAT153等）。不能通過接合轉移。 24個克隆位點。 1）普通載體元件 ① 表達載體的 結構 39 40 重要的質粒載體 ? pBR322 ? pUC18/19 41 pSP2124質粒的 Ampr基因 1. pBR322： （ 1）元件來源 F. Bolivar和 . Rodriguez人工構建載體。 Direct selection vectors 37 （ 6） 表達型質粒載體 主要用來使外源基因表達出蛋白質產物。 抗菌素抗性 外源 DNA 無抗菌素抗性 36 （ 5） 正選擇的質粒載體 如 pUR pTR262等。 如 pBEU pBEU2。 當有些被克隆的基因的表達產物過多時會嚴重地影響寄主菌的正常代謝活動，導致寄主菌死亡時，就需要低拷貝的載體。 抗菌素篩選原理 活 死 抗性基因 抗菌素 31 ② 遺傳標記 使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。殺死 生長的細菌 。 28 iv）鏈霉素（ Streptomycin， Str） a）殺菌原理 通過與 30S核糖體亞基結合，導致mRNA錯譯。 b）細菌抗性原理 Cmlr 編碼 乙酰轉移酶 ，特異地使氯霉素乙?；Щ?。 通過干擾細菌細胞壁合成的末端反應，殺死 生長的細菌 。 用來插入外源 DNA片斷。 （非接合型質粒分子量小，一般屬松弛型）。 Col質?；?R質粒如果帶有轉移基因，也可以成為接合型質粒。 （ 1） R質粒（抗性質粒）： 帶有一種或數種 抗生素抗性基因 ，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（ resistance）。 如： F質粒（性質粒、或 F因子）： 甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉移到原先不存在該質粒的受體菌中。 如抗菌素抗性、代謝特征等，賦予細菌一些額外的特性（非必須）。 6 第一節(jié) 質粒載體 7 ? 質粒（ plasmid） ：指細菌等生物細胞內一類獨立于染色體外而能自我復制的遺傳物質。 ? （ 4）分子量小，拷貝數多。 2 基因工程對載體 的要求 ? （ 1）在宿主細胞內能獨立復制。 ? 復制子：載體上有特殊的復制起點，使其能夠攜帶外源基因在宿主細胞中獨立復制繁殖 ? （ 2）有利于檢測篩選的標記。 ? （ 5）容易從宿主細胞中分離純化。 （ 1）分子?。? 一、質粒的一般生物學特性 1—200 kb （ 2）編碼基因少： 2—3個中等大小的蛋白質。 8 （ 4）質粒的空間構型： ① 共價閉合環(huán)狀 DNA（ cccDNA) 呈超螺旋（ SC）（ super coil） Covalent close circular DNA 9 ③ 線形 DNA （ linear ， lDNA） 一條鏈上有一至數個缺口。 又叫 自我轉移型質粒 。 符合基因工程的安全要求。 18 三、質粒的復制類型 1. 嚴緊型質粒（ stringent plasmid） 拷貝數少 ，只有 1—3份拷貝。 19 天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。且插入后不影響復制功能。 a）抑菌原理 b）細菌抗性原理 Ampr基因編碼 ?內酰胺酶 ，特異地切割氨芐青霉素的 ?內酰胺環(huán)。 a）抑菌原理 27 a）殺菌原理 iii）卡那霉素（ kanamycin， Kan） 通過與 70S核糖體結合，導致 mRNA發(fā)生錯讀。 殺死細菌 。 Tetr 編碼特異性蛋白質，對細菌的膜結構進行修飾，組止四環(huán)素通過細胞膜進入細菌細胞內。 32 人工構建的質粒載體的類型 （ 1）高拷貝數的質粒載體 ColE pMB1派生質粒具有高拷貝數的特點。 pLG33 pLG33 pHSG415等 不適合大量擴增 DNA用。 runaway plasmid vectors 1979年 B. E. Uhlin等構建。 只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長。 如果在大腸桿菌里表達，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉錄—翻譯信號控制之下。 ① 復制起點 ori pMB1系列（來源于 ColE1）的 高拷貝 型復制起點 ② Ampr基因 ③ Tetr基因 pSC101的 Tetr 基因。 43 44 （ 5） pBR322的優(yōu)點 ① 雙抗菌素抗性選擇標記 插入失活，分兩次先后選擇： 沒有獲得載體的寄主細胞 ? 在 Amp或 Tet中 都 死亡。 ③ 高拷貝數 ② 分子小，克隆能力大 載體越小越好。 pAT153： 從 pBR322上切去 HaeII片斷，既除去了 mob識別位點，又增加質粒的拷貝數。 ② 改造 EcoR I 位點 50 2. pUC系列 University of California的 J. Messing和 J. Vieria于 1978年，在 pBR322的基礎上改造而成。 53 pUC18/19 54 G A A T T C G A G C T C G G T A C C C G G G G A T C C T C T A G A G T C G A C C T G C A G G C A T G C A A G C T T5 ’3 ’EcoRI SacI KpnISm aIXm aIBam HI X baI SalIAccIHincIIPstI SphI Hind ⅢpUC 18l ac Z ’A A G C T T G C A T G C C T G C A G G T C G A C T C T A G A G G A T C C C G G G G T A C C G A G C T C G A A T T C5 ’3 ’EcoRISacIKpnISm aIXm aIBam HIX baISalIAccIHincIIPstISphIHind ⅢpUC 19l ac Z ’55 Ampicillin 抗性 和 lacZ的 ?肽互補 （藍白斑）相結合。又能分解 X－ gal。 lacZ’ 5’ 3’ ?肽移碼突變 lacZ’ 5’ 3’ ?肽 不互補 互補 MCS 外源 DNA 61 ④ IPTG的誘導作用 IPTG ( Isopropyl βD1Thiogalactopyranoside )是乳糖的類似物。 MCS無插入時，互補，藍菌斑。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性 在含抗菌素和 Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng) 有白色菌斑生長 64 65 （ 5） pUC系列載體的優(yōu)點 ① 更小的分子量： 如 pUC18為 2682bp， pUC8為 2750bp。 G A A T T C G A G C T C G G T A C C C G G G G A T C C T C T A G A G T C G A C C T G C A G G C A T G C A A G C T T5 ’3 ’EcoRI SacI KpnISm aIXm aIBam HI X baI SalIAccIHincIIPstI SphI Hind ⅢpUC 18l ac Z ’M13mp18的多克隆位點 67 六、其它質粒載體 1. pGEM3Z 由 pUC派生而來。 ③ MCS與 pUC18的完全一樣。 ③ 可以自如地在兩種不同寄主細胞之間來回轉移基因。 2. 質粒分配方式 具有一個控制質?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)（ Par），能以主動分配的方式確保質粒能正確分配到兩個子細胞中。 77 在寄主菌細胞分裂的過程中，有一個細胞沒有獲得質?？截?，并最終繁殖成無質粒的優(yōu)勢群體。 ② 轉錄和翻譯負荷 丟失質粒的細胞反而會成為優(yōu)勢群體！ 80 每個菌體中所擁有的質?？截悢挡煌耆嗤Q差度。 81 野生型 ，質粒在寄主的 重組酶 作用下會發(fā)生重組形成 二聚體質粒 。 一、噬菌體的一般特性 結構： 蛋白質外殼內包裹著 DNA（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等）。 烈性噬菌體（ virulent phage) 89 90 91 2. 溶原周期： 感染細菌后，將自己的 DNA整合到細菌的染色體 DNA中。 溶源性細菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細菌 溶源化： 用溫和噬菌體感染細菌培養(yǎng)物使之形成溶 源 性細菌的過程 整合： 噬菌體的 DNA是被包容在寄主細胞染色體 DNA中 原噬菌體：在溶源細菌內存在的整合的或非整合的 噬菌體 超感染免疫性：溶源性細菌不能夠被頭一次感染并 使 之溶源化的同種噬菌體再感染 93 94 溶源周期的主要特征： λ 噬菌體 特征 ： 噬菌體的 DNA分子注入細菌細胞 經過短暫的轉錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉錄活性便被一種阻遏物所關閉 噬菌體的 DNA分子插入到細菌染色體基因組 DNA上，變成原噬菌體 細菌繼續(xù)生長、 增殖， 噬菌體的基因作為細菌染色體的一部分進行復制。 （ 5）可產生大量的含有外源 DNA插入片 斷的 單鏈分子 ，便于作探針或測序。 成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也容易提取。 （ 2） DNA長度 （ 3） DNA提純 （ 1）寄主 98 99 （ 4） M13的生活周期 雖然不導致溶菌，但使菌斑混濁（細菌生長變慢，約為正常的 1/2—3/4） M13通過雄性細菌的 F性須 注入其 +DNA +DNA合成－ DNA，形成 RF dsDNA － DNA轉錄 mRNA、合成 +DNA、翻譯形成噬菌體蛋白 組裝成新的噬菌體 M13， 擠出寄主細胞 100 +DNA DNA mRNA M13外殼蛋白 組裝成子代 M13 +DNA 注入大腸桿菌 復制 轉錄 翻譯 +DNA 指導合成 +DNA 200個 RF DNA 每個細胞可以放出約 1000個 M13顆粒！ 101 3. M13載體的構建： M13基因組中只有基因 II與基因 IV之間存在一段 507bp的基因間隔區(qū)。 103 在 IG區(qū)內插入一個大腸桿菌的 LacZ’（ ?肽序列 )。 M13mp2： 106 5’ATGACCATGATTACGGATTCA Me 用 N甲基 N亞硝基脲 把 G甲基化 5’ATGACCATGATTACGGATTCA 轉染 。 RF Nicked by gene 2 protein + ssRolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phage released from the cell. 114 ① 插入外源 DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降 ② 實際克隆能力小于 1500bp。 既能在大腸桿菌中以質粒的形式雙鏈復制，又能在噬菌體內進行單鏈復制。 每個細胞能達到 500個拷貝。 如 M13K