【正文】 平板上 空載體 轉(zhuǎn)化子 (amprtetr)因插入外源 DNA而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱之為 插入失活效應(yīng) 。 4363bp， 106Da，（ 2）具有 兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。3種限制酶單一識別位點(diǎn) 堿裂解法216。 非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒 ，不含 tra基因；可以為轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒所帶動轉(zhuǎn)移。沒有選擇壓力的情況下 ， 兩種親緣關(guān)系密切的質(zhì)粒，不能夠長期穩(wěn)定的共存于同一宿主細(xì)胞中。 “嚴(yán)緊型 ”質(zhì)粒（ stigent蛋白合成 發(fā)生錯讀 殺菌劑 ,與 70S結(jié)合 ,mRNA編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶 ,使氯霉素宿主菌抗性機(jī)理氨芐青霉素（ Amp） 在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。n ⑷ 自身分子量較小，拷貝數(shù)高。載體概念：n 在基因工程中，攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。5 基因工程載體本章教學(xué)目的和要求 ：n 掌握載體的概念，載體具備的條件，構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略和過程；n 熟悉重要克隆載體的結(jié)構(gòu)，特殊用途的載體；n 了解基因打靶載體，人工染色體克隆載體。Characteristics of vectors for gene cloningMCSMarkerForeignn ⑸ 在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高。p大腸桿菌的質(zhì)粒主要有 F質(zhì)粒（ F因子）、 R質(zhì)粒（抗藥性因子）和 Col質(zhì)粒（大腸桿菌素因子）三種?？咕孛Q ?內(nèi)酰胺環(huán)氯霉素（ Cml） 蛋白質(zhì)合成 修飾 Kan失活鏈霉素（ Sm） 結(jié)構(gòu) ,阻止 Tet通過細(xì)胞膜 （一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性（ 4） 質(zhì)粒的大小 差異很大 ， 最小的只有 1kb,只能編碼中等大小的 23種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到 200kb。 plasmid）： 拷貝數(shù)為 13；“松弛型 ”質(zhì)粒（ relaxed（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性（ 8） 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移 接合型質(zhì)粒分子量大嚴(yán)緊型復(fù)制 轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒 ，含有 tra基因；能通過結(jié)合作用從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞。煮沸裂解法（三）質(zhì)粒載體的改造 策略⑴ 去掉非必需的 DNA區(qū)段⑵ 減少限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的數(shù)目⑶ 加入易于撿出的選擇性標(biāo)記基因氨芐青霉素抗性（ Ampr）四環(huán)素抗性（ Tetr)新霉素抗性（ Neor）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（ CAT）卡那霉素抗性（ Kanr）⑷ 對質(zhì)粒進(jìn)行安全性改造，要求質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移。（ 2）四環(huán)素抗性基因（ tetr或 Tcr）內(nèi)部有 7種，啟動區(qū)內(nèi)有 2種限制酶單一識別位點(diǎn) pBR3224363外源 DNApBR3224363PstI酶切PstI酶切黏性末端黏性末端連接酶 重組子 (ampstetr)對比兩個平板上的菌落，凡在 Tc平板上生長而在 Ap平板上不能生長的菌落則是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽性克隆，分離出重組質(zhì)粒。（ 3）環(huán)絲氨酸如果在 Tetr上插入外源 DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用 四環(huán)素加環(huán)絲氨酸 平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。pUC質(zhì)粒載體1987年， 用 MCS技術(shù)在 pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建的。編碼 β— 半乳糖酶的 α— 肽鏈即氨基末端。686bp， 控制質(zhì)粒復(fù)制rop基因的缺失，平均每個細(xì)胞即可達(dá) 500～ 700個拷貝（ 2）適用于組織化學(xué)法檢測重組體通過 ?互補(bǔ) 作用，利用菌落顏色篩選重組子。大腸桿菌 ?半乳糖苷酶 可以和其底物 XGal這樣一來，含有功能性完整的 LacZ’LacZ’插入外源基因被破壞，菌落則是無色的 用這種載體進(jìn)行克隆時， β半乳糖苷酶基因的被外源 DNA片段插入，所產(chǎn)生的重組體喪失 α互補(bǔ)能力，在含有 Xgal和 IPTG的平板下形成無色菌斑。pGEM3Z216。選擇標(biāo)記基因 Apr lacZ’注意： T7和 SP6啟動子特異性地由噬菌體 DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體 RNA聚合酶，如： phage)： 能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體，并最終裂解細(xì)菌。 溫和噬菌體的基因組能與宿主菌基因組整合，并隨細(xì)菌分裂傳至子代細(xì)菌的基因組中，不引起細(xì)菌裂解。一個空斑系由一個噬菌體復(fù)制增殖并裂解細(xì)菌后形成，稱為 噬菌斑 (plaque),不同噬菌體噬斑的形態(tài)與大小不盡相同。–TCCAGCGGCGGGG3‘， 3’大腸桿菌的 l 噬菌體 DNAlDNA載體的構(gòu)建： 縮短長度 野生型 lDNA包裝的上限為 51kb，本身長度為 ，只有當(dāng)插入的外源 DNA片段不大于 ，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。大腸桿菌的 l 噬菌體 DNAlDNA載體的構(gòu)建： 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn)野生型的 lDNA鏈上有 5個 EcoRI位點(diǎn)和 7個 HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至 1 2個同時，為了便于各種來源的 DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)。含有完整標(biāo)記基因的 l載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源 DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活， l重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。其 DNA中約有 20kb是非必需區(qū)段。包裝時，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組 lDNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組 lDNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計的。超速離心，沉淀噬菌體 lDNA載體的裝載能力為 25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量 Charon–　 Charon020CharonCharon–1050101n 柯斯質(zhì)粒（ cosmid） =cos序列 +質(zhì)粒?？滤官|(zhì)粒載體 pHC79system） 末端酶或 Ter體系sequence)*ssDNA(+鏈 )進(jìn)入細(xì)胞。b)鏈 ,成為雙鏈復(fù)制型 DNA(RFDNA),同時在宿RFDNA與特異性蛋白結(jié)合，組裝成新的噬菌體顆粒。RFn M13DNA在宿主菌內(nèi)既可以是單鏈也可以是雙鏈。插入 M13的外源 DNA超1000bp時就不穩(wěn)定，在噬菌體增殖時會出現(xiàn)缺失。 1992年在大腸桿菌的 F因子（大小約100kb）的基因礎(chǔ)上構(gòu)建。artificialn YAC的特點(diǎn)：酵母人工染色體載體(yeastrepeatCEN） leu 2端粒重復(fù)序列著絲粒自主復(fù)制序列SUP4酶失活的酵母菌落呈 紅色 ；不失活的菌落是白色?？寺⊥庠?DNA正常酵母人工染色體含有：*(CEN)*?3），在缺口中形成三鏈結(jié)構(gòu)．花椰菜花斑病病毒 DNA缺口的結(jié)構(gòu)缺口 1： GA ATTT TTT AA