基因工程第四章工具酶-資料下載頁
2025-01-06 02:26本頁面
【正文】 A ，末端搭連后，作用力是由 4個(gè) AT堿基對維持， 37度下，他們的作用并不牢靠。但溫度低末端連接慢。 我們在實(shí)驗(yàn)室操作中往往采用 4－ 15℃ 比較合適，這個(gè)溫度是介于酶的作用速率和末端結(jié)合速率之間，一般認(rèn)為 4℃ 連接反應(yīng)進(jìn)行較慢。連接反應(yīng)可以是 4℃ 連接 24小時(shí)，或 15℃ 過夜（注意參照說明書）。 ?DNA連接酶用法與用量： 平末端 DNA分子的連接最適反應(yīng)的酶量為 1－ 2個(gè)單位， 粘末端的連接，酶量為 。 polymerase Section three ?DNA聚合酶 ?DNA聚合酶 I Klenow大片段 ?T4 DNA聚合酶 ?反轉(zhuǎn)錄酶 ?Taq酶 共同點(diǎn)：以一條 DNA（ RNA）為模板，通過聚合作用能夠把脫氧核糖核酸連續(xù)的加到引物鏈的 3－ OH末端。 一、 DNA聚合酶 I ? 大腸桿菌的 DNA聚合酶 I是一條約 1000個(gè) aa 的多肽鏈形成的單亞基蛋白，分子量 109x103Da. 1. 三種活性： 聚合活性：將 4種脫氧核糖核苷酸聚合為新的 DNA鏈。 53外切酶活性 : 35外切酶活性：防止錯(cuò)配。 2. DNA聚合酶 I催化合成 DNA鏈的條件： 四種核苷酸， 游離的－ OH 模板鏈 3. 作用： DNA雜交的探針制備：依靠 DNA聚合酶缺口平移。由于 DNA聚合酶 I具有 5－ 3外切酶活性，切下后，聚合酶活性表現(xiàn)出來，又加上一個(gè)新的堿基可使切刻由 5－ 3的方向移動(dòng)，加上的dNTP用 P標(biāo)記，這樣換上的新鏈上就有了放射性標(biāo)記。 二、 klenow 片斷： ?用蛋白酶處理大腸桿菌 DNA聚合酶 I產(chǎn)生兩個(gè)片斷，一個(gè)片斷帶有 5――3 外切酶活性；一個(gè)片斷失去 5――3 外切酶活性，而保留下兩種活性，該片斷的分子量為 76 x 103 dal, 這個(gè)片段就是 Klenow大片段。 ?作用：可對 3‘隱藏性末端進(jìn)行修補(bǔ)，尤其是被內(nèi)切酶消化后標(biāo)記 DNA片斷的末端； cDNA合成中催化第二條鏈的合成（ DNA聚合酶 I也可，但安全性差，可能會(huì)將原鏈切割。） NH2 cooH 323 Polymerase exonuclease 5’→ 3’ 生物工程
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