【正文】 ?天為時(shí)代 : HotStart Taq ? Roche : FastStart Taq ? Abgene: THERMOSTART174。 DNA Polymerase ? Stratagene: SureStart? Taq 大大提高 PCR反應(yīng)的特異性 化學(xué)修飾不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn) 抗體抑制 ? Invitrogen： AccuPrimeTM Taq Platinum174。 Taq ? TaKaRa： ExTaqTM HotStart Version 蠟封 ?Promega： TaqBeadTM HotStart 熱啟動(dòng) Taq酶 基因工程－－第四章 基因操作過程 特點(diǎn)： 3′→5′ 核酸外切酶活性，降低堿基錯(cuò)配率 用途： 表達(dá)基因的克隆 基因的定點(diǎn)突變 細(xì)胞內(nèi)基因點(diǎn)突變分析（ SNP） 高保真酶 基因工程－－第四章 基因操作過程 產(chǎn) 品 類 型 生 物 公 司 性 能 比 較 Pfu DNA Polymerase ? 天為時(shí)代 ? Stratagene ? Promega 在目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐熱聚合酶中 , Pfu保真度最高堿基錯(cuò)配率最低 PyrobestTM DNA Polymerase TaKaRa Tli DNA Polymerase Promega 基因工程－－第四章 基因操作過程 Promega中國公司 普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品 基因工程－－第四章 基因操作過程 高保真 ＋ 高擴(kuò)增效率 混合酶 －熱啟動(dòng)耐熱聚合酶 － 3′→5′ 核酸外切酶 用途 超長片段擴(kuò)增、測序 構(gòu)建基因圖譜 復(fù)雜模板擴(kuò)增： GC含量高、 二級結(jié)構(gòu) 基因工程－－第四章 基因操作過程 特 點(diǎn) 產(chǎn) 品 性 能 高擴(kuò)增效率 ? 天為時(shí)代 ： Taq Plus ? TaKaRa： Ex TaqTM 復(fù)雜模板擴(kuò)增 高保真 ?天為時(shí)代 ： Taq Platinum ? Invitrogen： Pfx Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 保真度低于 Pfu聚合酶 但擴(kuò)增效率較高 長片段擴(kuò)增 ?天為時(shí)代 ： Long Taq ? TaKaRa： LA Taq ? Invitrogen： Elongase Amplificaiton System 特別適用于保真度較高的 超長片段擴(kuò)增 基因工程－－第四章 基因操作過程 controlled temperature controlled rate of temperature change Thermocycler 基因工程－－第四章 基因操作過程 Gradient Thermocycler an automatic machine, a putercontrolled thermal block, in which the temperature can be rapidly changed and finely controlled 基因工程－－第四章 基因操作過程 引物是 PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵， PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA互補(bǔ)的程度。 ⑤ 引物 Ⅰ 設(shè)計(jì)引物的原則 引物長度： 1530bp，常用為 20mer左右 引物的有效長度不能大于 38 mer，否則最適延伸溫度會(huì)超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（ 74℃ ），不能保證 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性 基因工程－－第四章 基因操作過程 引物擴(kuò)增跨度：以 500bp為宜 特定條件下可擴(kuò)增長至 10kb的片段 引物堿基： G+C含量以 4060%為宜 G+C太少擴(kuò)增效果不佳， G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶 ATGC最好隨機(jī)分布，避免 5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu) 避免兩條引物間互補(bǔ)， 特別是 3’ 端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶 基因工程－－第四章 基因操作過程 ⑤ 引物 3′端的堿基要求嚴(yán)格配對 特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗 ⑥ 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn) 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處 ⑦ 引物的特異性： 引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性 基因工程－－第四章 基因操作過程 引物量： 每條引物的濃度 ~ 1umol或 10 ~ 100 pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好 引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì) 引物的解鏈溫度 兩個(gè)引物之間的 Tm 值差異最好在 25℃ 基因工程－－第四章 基因操作過程 Ⅱ 簡并引物設(shè)計(jì)（ degenerate primers) 如： Asn PheTyr Ala 對應(yīng)的核苷酸序列 (?) AAU UUU UAU GCU AAC UUC UAC GCC 等 N /A T C G 基因工程－－第四章 基因操作過程 Ⅲ 設(shè)計(jì)引物的方法 設(shè)計(jì)引物的操作流程 同源性比較 序列下載 引物設(shè)計(jì)篩選 根據(jù)所需要檢測的基因在 查詢有關(guān)序列 利用 primer premier 基因工程－－第四章 基因操作過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 同源性比較 中在線比較 采用 OMIGA， PGCENE進(jìn)行兩兩比較或多序列比較 基因工程－－第四章 基因操作過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 上游引物 下游引物 發(fā)莢結(jié)構(gòu)，點(diǎn)擊顯示的△ G的絕對值不應(yīng)大于 5，所形成的發(fā)莢結(jié)構(gòu) 3′端為突出端影響較小， 5′端影響較大 引物自身形成二聚體，點(diǎn)擊顯示的△ G的絕對值不應(yīng)大于 5 引物在目標(biāo)基因序列中間形成錯(cuò)配的情況，點(diǎn)擊顯示的△ G的絕對值不應(yīng)大于 15 上下游引物形成配對的情況，點(diǎn)擊顯示的△ G的絕對值不應(yīng)大于 5 這幾個(gè)參數(shù)對引物設(shè)計(jì)的影響順序：False Priming Hairpin and Cross DimerDimer 得到產(chǎn)物的機(jī)率，應(yīng)大于 50% 基因工程－－第四章 基因操作過程 ⑥ PCR反應(yīng)條件的選擇 溫度與時(shí)間的設(shè)臵 三溫度點(diǎn)法 雙鏈 DNA在 90～ 95℃ 變性，再迅速冷卻至 40 ～ 60℃ ，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至 70～75℃ ，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸 (標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng) ) 二溫度點(diǎn)法 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用 94℃ 變性， 65℃ 左右退火與延伸 (此溫度 Taq DNA酶仍有較高的催化活性 )。 較短靶基因 (長度為 100～ 300bp)時(shí) 基因工程－－第四章 基因操作過程 變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致 PCR失敗的最主要原因。一般情況下， 93℃ ～ 94℃ 1min足以使模板 DNA變性，若低于 93℃ 則 需延長時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或 PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致 PCR失敗。 變性溫度與時(shí)間 基因工程－－第四章 基因操作過程 退火溫度是影響 PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至 40℃ ～ 60℃ ，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板 DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長 度。對于 20個(gè)核苷酸， G+C含量約 50%的引物，55℃ 為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。 退火 (復(fù)性 )溫度與時(shí)間： 基因工程－－第四章 基因操作過程 引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值 (解鏈溫度 )=4(G+C)＋ 2(A+T) 復(fù)性溫度 =Tm值 (5～ 10℃ ) 在 Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高 PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為 30～ 60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 基因工程－－第四章 基因操作過程 Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性： 70～ 80℃ 150核苷酸 /S/酶分子 70℃ 60核苷酸 /S/酶分子 55℃ 24核苷酸 /S/酶分子 高于 90℃ 時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。 延伸溫度與時(shí)間： PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 70～ 75℃ 之間，常用溫度為 72℃ ，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。 PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般 1Kb以內(nèi)的 DNA片段，延伸時(shí)間 1min是足夠 的。 3～ 4kb的靶序列需 3～ 4min；擴(kuò)增 10Kb需延伸至 15min。延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些。 基因工程－－第四章 基因操作過程 循環(huán)次數(shù)決定 PCR擴(kuò)增程度。 PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在 30～ 40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 循環(huán)次數(shù) 基因工程－－第四章 基因操作過程 ⑦ PCR實(shí)驗(yàn)操作過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 PCR產(chǎn)物純化 基因工程－－第四章 基因操作過程 PCR產(chǎn)物純化試劑盒 基因工程－－第四章 基因操作過程 PCR產(chǎn)物電泳 ⑧ PCR常見問題 正對照有條帶，而樣品則無 原因： 該 Buffer對樣品不合適 引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解 模板 :含有抑制物，含量低 反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短 優(yōu)化 純化模板或者使用試劑盒提取模板 DNA 更換 Buffer或調(diào)整濃度 重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)） 或者換一管新引物 降低退火溫度、延長延伸時(shí)間 基因工程－－第四章 基因操作過程 非特異性擴(kuò)增 現(xiàn)象： PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致 ， 或大或小 ， 或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶 原因： 1. 引物特異性差 2. 酶純度不高 3. Mg2+濃度偏高 4. 退火溫度偏低 5. Buffer不合適 6. 循環(huán)次數(shù)過多 解決： 1. 重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式 PCR 2. 換用高純度的酶 3. 降低鎂離子濃度 4. 適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 5. 更換 Buffer 6. 減少循環(huán)次數(shù) 基因工程－－第四章 基因操作過程 拖尾 現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈 Smear狀態(tài) 原因： 1. 酶量過多 2. 模板不純 3. 循環(huán)次數(shù)過多 4. dNTP、 Mg2+濃度偏高 5. 退火溫度偏低 6. Buffer不合適 解決： 1. 適量用酶 2. 純化模板 3. 減少循環(huán)次數(shù) 4. 適當(dāng)降低 dNTP和鎂離子的濃度 5. 適當(dāng)提高退火溫度 6. 更換 Buffer 基因工程－－第四章 基因操作過程 假陽性 現(xiàn)象： 空白對照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物 原因： 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染 對策： 1. 操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外 2. 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。 3. 各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存 。 基因工程－－第四章 基因操作過程 It’ s over!! Thank you!!