【正文】 司 性 能 比 較 Pfu DNA Polymerase ? 天為時(shí)代 ? Stratagene ? Promega 在目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐熱聚合酶中 , Pfu保真度最高堿基錯(cuò)配率最低 PyrobestTM DNA Polymerase TaKaRa Tli DNA Polymerase Promega 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 Promega中國(guó)公司 普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 高保真 ＋ 高擴(kuò)增效率 混合酶 －熱啟動(dòng)耐熱聚合酶 － 3′→5′ 核酸外切酶 用途 超長(zhǎng)片段擴(kuò)增、測(cè)序 構(gòu)建基因圖譜 復(fù)雜模板擴(kuò)增： GC含量高、 二級(jí)結(jié)構(gòu) 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 特 點(diǎn) 產(chǎn) 品 性 能 高擴(kuò)增效率 ? 天為時(shí)代 ： Taq Plus ? TaKaRa： Ex TaqTM 復(fù)雜模板擴(kuò)增 高保真 ?天為時(shí)代 ： Taq Platinum ? Invitrogen： Pfx Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 保真度低于 Pfu聚合酶 但擴(kuò)增效率較高 長(zhǎng)片段擴(kuò)增 ?天為時(shí)代 ： Long Taq ? TaKaRa： LA Taq ? Invitrogen： Elongase Amplificaiton System 特別適用于保真度較高的 超長(zhǎng)片段擴(kuò)增 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 controlled temperature controlled rate of temperature change Thermocycler 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 Gradient Thermocycler an automatic machine, a putercontrolled thermal block, in which the temperature can be rapidly changed and finely controlled 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 引物是 PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵， PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA互補(bǔ)的程度。此步若不能使靶基因模板或 PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致 PCR失敗。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng) 度。 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性： 70～ 80℃ 150核苷酸 /S/酶分子 70℃ 60核苷酸 /S/酶分子 55℃ 24核苷酸 /S/酶分子 高于 90℃ 時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。延伸進(jìn)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。一般的循環(huán)次數(shù)選在 30～ 40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 It’ s over!! Thank you!! 。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 循環(huán)次數(shù)決定 PCR擴(kuò)增程度。 PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般 1Kb以內(nèi)的 DNA片段，延伸時(shí)間 1min是足夠 的。 退火 (復(fù)性 )溫度與時(shí)間： 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值 (解鏈溫度 )=4(G+C)＋ 2(A+T) 復(fù)性溫度 =Tm值 (5～ 10℃ ) 在 Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高 PCR反應(yīng)的特異性。變性后溫度快速冷卻至 40℃ ～ 60℃ ，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。 較短靶基因 (長(zhǎng)度為 100～ 300bp)時(shí) 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致 PCR失敗的最主要原因。 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 如何選擇最合適的 DNA聚合酶 －－ PCR 實(shí)驗(yàn)的不同需求 特 異 性： 基因組擴(kuò)增、 RTPCR 保 真 性： 基因篩選、測(cè)序、 TA克隆 長(zhǎng)片段擴(kuò)增： 構(gòu)建基因圖譜、測(cè)序、分子遺傳學(xué) 擴(kuò)增效率： 復(fù)雜模板擴(kuò)增（ GC含量高、二級(jí)結(jié)構(gòu)） PCR試劑盒： 復(fù)雜模板擴(kuò)增、大規(guī)?；驒z測(cè) 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 產(chǎn) 品 類 型 產(chǎn) 品 名 稱 產(chǎn) 品 性 能 化學(xué)修飾 ?天為時(shí)代 : HotStart Taq ? Roche : FastStart Taq ? Abgene: THERMOSTART174。 忠實(shí)性： 沒(méi)有校正單核苷酸錯(cuò)配功能 致命弱點(diǎn)。反應(yīng)最終的 DNA 擴(kuò)增量可用下面的公式計(jì)算。 集成軟件：如 BioEdit等 提供如少數(shù)序列的拼裝，同源性的比較，開(kāi)放閱讀框的查找，酶切位點(diǎn)的查找等功能。根據(jù)重疊序列，通過(guò)軟件處理，DNA序列信息 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 測(cè)序載體 pUC： 雙鏈質(zhì)粒載體，衍生的載體很多，不同商業(yè)公司有所不同，但基本均由 pUC衍生而來(lái)，使用時(shí)需先變性 M13系列和 pUC系列的測(cè)序載體的使用避免了使用物理方法分離大量的 DNA M13： 單鏈?zhǔn)删w載體，目前很少采用 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 測(cè)序 DNA聚合酶 ① DNA聚合酶 Ⅰ Klenow片段 5′→3′ 的聚合酶活性， 3′→5′ 的外切酶活性 持續(xù)合成能力不強(qiáng)，不能復(fù)制富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板區(qū) 以 ddNTP為底物的能力遠(yuǎn)比在 dNTP低 易受 DNA制備時(shí)經(jīng)常產(chǎn)生的污染物的影響，且只對(duì)單鏈模板有效 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 ② T7噬菌體聚合酶 (測(cè)序酶 ) 是一種經(jīng)過(guò)修飾的 T7噬菌體 DNA聚合酶，缺乏 3′→5′ 外切酶活性 能產(chǎn)生出非常漂亮的 DNA梯帶，每條帶都具有相似的強(qiáng)度，可讀的 DNA序列可覆蓋凝膠的全長(zhǎng) 測(cè)序酶催化 ddNTP結(jié)合的速率是 dNTP的 33% 具有 ， ，能對(duì)折疊成二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板起作用 測(cè)序酶 526位氨基酸為 Tyr，若換成 Phe，結(jié)合 ddNTP的能力下降 2022倍，將 Ⅰ 或 TaqdnaPol類似氨基酸換面 Tyr其結(jié)合 ddNTP的能力提高 8000倍 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 ③ TaqDNA聚合酶 它在高溫下（ 70℃ ）進(jìn)行終止鏈反應(yīng)的能力可減少測(cè)序反應(yīng)中由于模板 DNA上引物假結(jié)合位點(diǎn)與引物退火錯(cuò)配產(chǎn)生的相關(guān)問(wèn)題 在測(cè)序凝膠的放射自顯影片上條帶間的強(qiáng)度不同，從頂部到底部條帶逐漸減弱，出現(xiàn)陰影。CTTGACTAAATCCGA 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 原位雜交 (insitu hybridization) 菌落或噬菌斑雜交，將生長(zhǎng)在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來(lái)的位臵不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用 基本程序是：將被篩選的 大腸桿菌菌落或噬菌斑 ，從其生長(zhǎng)的瓊脂平板中 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜 上，進(jìn)行適當(dāng)?shù)?溫育 ，保藏原來(lái)的菌落平板作為參照，以便從中 挑取陽(yáng)性克隆 。 其原理是：載體分子上攜帶某種營(yíng)養(yǎng)組份的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營(yíng)養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營(yíng)養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的便是轉(zhuǎn)化子 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記： 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在兩條 dTTP的合成途徑： 用于 大腸桿菌 的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因 trp+ 用于 高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞 的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激 酶基因 tk，相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇 tk缺陷型 dCDP dTDP dTTP TR dTMP dTDP dTTP AP TK AP 氨基喋呤 TK 胸腺嘧啶核苷激酶 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 2 依賴重組子結(jié)構(gòu)特征的篩選法 ① 凝膠電泳法 帶有插人片段的重組體在相對(duì)分子質(zhì)量上會(huì)有所增加 分離質(zhì)粒 DNA并測(cè)定其分子長(zhǎng)度是一種直截了當(dāng)?shù)姆椒? 通常用比較簡(jiǎn)單的凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。 在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下 ， 細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙 ， 質(zhì)?；?DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大 同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn) 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 將細(xì)菌溶于 1～ 2ml 10%的甘油中，以 40～ 80μl/管分裝 70℃ 凍存，備用 挑一個(gè) DH10B的單菌落接種于 5ml 液體 LB中，過(guò)夜培養(yǎng) 1/100 接種后 37℃ ， 220轉(zhuǎn) /min，搖菌 2～３ h(OD500達(dá) ) 6000rpm,4℃ 離心 15min,收集菌體，以下均需在冰上操作 用等體積的滅菌去離子水徹底洗細(xì)菌沉淀，離心收集 用 1/2 的滅菌去離子水徹底洗細(xì)菌沉淀，離心收集 加入 20～ 30ml 10%的滅菌甘油洗細(xì)菌沉淀，離心收集 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 將脈沖電擊轉(zhuǎn)化儀打開(kāi)，調(diào)電壓為 從 70℃ 取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，解凍后置于冰上 每管感受態(tài)細(xì)胞加入 1μl 連接產(chǎn)物 ,轉(zhuǎn)移到電擊杯中 電擊，然后迅速向電擊杯中加入 1ml液體 LB培養(yǎng)基 將電擊后的菌液轉(zhuǎn)移至 Eppendorf管， 37℃ 恒溫?fù)u床培養(yǎng) 1h 鋪 100μl于含 Xgal和 IPTG的 Amp平板 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 9－ 16h 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 2510電轉(zhuǎn)儀，適用于原核細(xì)胞 適用于真核細(xì)胞電轉(zhuǎn)化及原生質(zhì)體融合 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 In vitro packaging and transfection 轉(zhuǎn)染（ transfection） 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 l噬菌體 DNA的轉(zhuǎn)染 感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)： 將大腸桿菌在含有麥芽糖 （ 不含葡萄糖 ） 和 MgCl2的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至 OD600 = 吸附： 加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液 ， 30℃ 保溫 10分鐘 轉(zhuǎn)染裂解： 加入 20倍體積的新鮮培養(yǎng)基， 30℃ 培養(yǎng) 2小時(shí)，直至培養(yǎng)液 中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 3 轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo) 轉(zhuǎn)化率 ：每微克載體 DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù) 在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為： 每微克載體 DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納 DNA的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不長(zhǎng)） 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 如： pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為 108，即每微克 pUC18中只有 108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。 微注射法： 將外源基因直接注射到真核受體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化酵母菌 植物細(xì)胞的 葉盤法基因轉(zhuǎn)移 2 重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 轉(zhuǎn)化（ transformation） 感受態(tài)的大腸桿菌捕獲和表達(dá)質(zhì)粒載體 DNA分子的生命過(guò)程 Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如 ） ① Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 1970年建立此技術(shù)，原理是 Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙， 細(xì)菌細(xì)胞處于容易吸收外源 DNA的狀態(tài)叫做 感受態(tài) (petent) 轉(zhuǎn)化子（ transforment） ： 導(dǎo)入外源 DNA后獲得了新的遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)胞或其它受體細(xì)胞。 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 粘性末端的更換 基因工程－－第四章 基因操作過(guò)程 4 同聚物加尾 (homopolymer tails joining)連接法