【正文】 噬菌體超感染免疫性：溶源性細菌不能夠被頭一次感染并 使之溶源化的同種噬菌體再感染。 由于 λ 噬菌體包裝時，當 DNA的長度短于野生型的 78%或超過 105%時，噬菌體的活性就急劇下降。插入式載體： ?cI基因插入失活 ：如 λ gt10 等載體，在 cI基因上有 EcoR I及 Hind III的酶切位點。 ?Lac Z基因插入失活 ：如 charon16A載體，在非必須區(qū)段引入 lac Z基因，在 lac Z基因上有 EcoR I位點，插入失活后利用 Xgal法篩選（蘭白篩選）。這是一類用于克隆大片段 DNA的載體，它是由 λ 噬菌體的 cos（ cohesive site）末端 及質(zhì)粒 （ plasmid）重組而成的載體。其上的 cos位點的一個重要作用是識別噬菌體的外殼蛋白?？滤官|(zhì)粒載體的特點1. 具有 λ噬菌體的特性；2. 具有質(zhì)粒載體的特性；3. 具有較高容量的克隆能力 (40Kb)；柯斯質(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒 pBR322和噬菌體 λ 的cos位點的一段 DNA構成全長 單鏈 DNA噬菌體載體 (M13)M13噬菌體載體? M13是一種含單鏈（ +） DNA（ ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為 。 ? 可以定向地克隆 DNA片段，克隆在 M13 RF DNA分子上的雙鏈 DNA片段，到了子代噬菌體便成了單鏈的形式。 它具有質(zhì)粒的復制起點、選擇性標記、多克隆位點等，方便 DNA的操作，可在細胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈噬菌體的復制起點，在 輔助噬菌體 的存在下，可進行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。 YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點 (centromere)及復制起點等功能序列，可插入長度達 200500kb的外源 DNA，導入酵母細胞可以隨細胞分裂周期復制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計劃的重要載體。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細胞。 表達載體除了具有克隆載體所具備的復制起始位點，抗性基因和多克隆位點外，還需具備轉錄和翻譯所必需的元件。 42度時，阻遏蛋白失活； 2830度時， PL啟動子完全被阻遏蛋白抑制。真核表達載體 主要包括質(zhì)粒載體和病毒載體，使用的調(diào)控表達元件最初多來源于病毒SV40病毒載體逆轉錄病毒載體腺病毒載體腺相關病毒載體第四節(jié) 基因克隆的一般過程基因克隆的基本過程 1． 重組 DNA導入受體細胞5． 2. 根據(jù)實驗目的（表達或擴增）等等三、目的基因與克隆載體的連接（一）粘性末端連接 —— 單酶單切點 用同一種酶分別切割目的基因 /載體，然后進行連接。 （ 2）不能定向克隆 /插入 由于是單一位點，目的基因可以以不同方向插入載體。 如：目的基因和載體都有 EcoRⅠ ， PstⅠ 酶切位點，產(chǎn)生各自互補粘端，分別配對連接。5. 聚合酶鏈反應特異引物連接 利用 PCR技術，將 PCR引物的 5’ 端加上限制性內(nèi)切酶的切點。（二）平頭末端的連接平端的 4個來源 載體 目的基因 連接或克隆策略① 少數(shù)限制酶如 HaeⅡ 對稱切產(chǎn)生平端√ √ cDNA ① 目的基因載體平端平端連接② 機械剪切 DNA產(chǎn)生平端 √ √ cDNA ② 加人工接頭連接（cDNA/vector）③ 逆轉錄生成 cDNA是平端√ cDNA ③ 用銜接接頭取代人工接頭連接（ cDNA/vector）④ 5’端突出，用酶切平，或用酶填平 3’端； 3’端突出只能切平，不能填平產(chǎn)生平端√√cDNAcDNA④ 通過同聚尾連接(cDNA/vector)（一）序言1. 導入目的 （ 1）克隆擴增 rDNA導入宿主細胞，利用宿主的生理條件，克隆擴增，克隆片段隨著載體（如質(zhì)粒）一起擴增獲得擴增 DNA片段（如細菌分裂繁殖）。（ 2）真核細胞 一般只用作基因表達系統(tǒng)。 （二）質(zhì)粒轉化 可用含抗生素的平板篩選，挑選陽性克隆分析鑒定轉化子（圖 83）。確定外源 DNA片段是否插入并與載體連接。 PBR322的細菌先涂布于含Amp的瓊脂板上，存活者必定是轉化子。⒉JM103 受體菌含 lacz(c)可以編碼 β －半乳糖苷酶的 C端部分⒊α －互補 當載體轉入 JM103 lacz(n)與 lacz(c) α 互補，編碼具有活性酶 pr→ 使底物 Xgal生色（ 5溴 4氯 3吲哚 β －半乳糖苷產(chǎn)生蘭菌落）。（二）免疫學方法 western blotting，檢測外源基因的表達產(chǎn)物。2. 抑制蛋白降解 融合蛋白表達。大腸桿菌中表達體系的不足 ： 1. 真核基因，在結構上同原核基因之間存在著很大的差別。4. 許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過轉譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類修飾作用在細菌細胞中并不存在；5. 細菌的蛋白酶，能夠識別外來的真核基因所表達的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。SV40病毒載體逆轉錄病毒載體腺病毒載體腺相關病毒載體真核細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點優(yōu)點l重組質(zhì)粒轉染的細胞具有遺傳的穩(wěn)定性和可重復性。l蛋白產(chǎn)物對宿主細胞的影響不大，且自身也很少降解。l可表達基因組 DNA，也可表達 cDNA。 常用的真核表達體系有酵母，昆蟲和哺乳類動物細胞等。 細菌的 RNA聚合酶不能識別真核的啟動子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉錄終止信號功能的核苷酸序列。 3. 維持和恢復蛋白質(zhì)特異空間結構控制目的蛋白占總細菌蛋白的量，防止形成包涵體。調(diào)整 SD序列和起始密碼子之間的距離。PUC19PlacLacZ(N)MCSJM 103外源基因片段插入 白菌落IPTGlacz(c) Xgal 藍菌落β半乳糖苷酶圖 α互補①②③④C. 噬菌斑篩選 噬菌體系列載體包裝外源 DNA后的重組分子的長度必需是其野生型長度的 75%105%時，方能形成有活性的噬菌體顆粒，在培養(yǎng)平板上出現(xiàn)清晰的噬菌斑。五 重組體的篩選與鑒定（一）遺傳學方法2. 遺傳標記補救篩選 A 二氫葉酸還原酶（ DHFR)標記基因 用于外源基因?qū)氩溉閯游锛毎箨栃钥寺〉暮Y選。 插入失活應用舉例 含 Ampr和 tetr,后者含 BamHI和 SalI 2個單一限制酶切點，具有 Ampr和 tetr表型。 轉化菌中有一部分是重組子，質(zhì)粒載體就是粘端基因的重組體，含有載體抗生素抗性基因，可在含抗生素平板上存活。3. 轉化和轉染（ transformation/transfection） rDNA導入原核細胞的過程稱轉化，導入真核稱轉染。 受體細胞 接受 rDNA分子的細胞稱作受體細胞或宿主細胞。（ 1） cDNA末端添加 AA 利用 Taq pol延伸活性，以不依賴模板的方式在已完成延伸的 PCR產(chǎn)物的 3’端添加 AA（利用 DNA pol活性可成） 。dC： dG同源多聚尾是連接 DNA片段克隆 cDNA的有效方法。 —— 雙酶雙切點（定向克?。? 優(yōu)點（ 1）避免載體 /目的基因的自身環(huán)化，提高連接效率；（ 2）可控制外源基因插入方向。 如： gene EcoRⅠ vector EcoR Ⅰ問題與解決辦法： （ 1）自身環(huán)化 粘性末端自發(fā)形成雙鏈，連接產(chǎn)物含大量的目的基因和載體自身環(huán)化的假重組體－ 若轉化則出現(xiàn)假陽性克隆。6． 制備目的基因片段3． u真核生物表達調(diào)控的元件，包括啟動子，增強子、轉錄終止和 polyA加尾信號。