【正文】 。 （ 2）克隆表達 利用宿主的生理條件，生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品或開展基因治療。 受體細胞 接受 rDNA分子的細胞稱作受體細胞或宿主細胞。（ 1）原核細胞 既可以復(fù)制擴增，也可以基因表達。（ 2）真核細胞 一般只用作基因表達系統(tǒng)。四、重組 DNA（ rDNA）導入受體細胞2. 受體細胞的基本條件 (1)易接納 rDNA分子； (2)對載體復(fù)制擴增無嚴格限制； (3)不降解，不修飾外源DNA分子。3. 轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染（ transformation/transfection） rDNA導入原核細胞的過程稱轉(zhuǎn)化，導入真核稱轉(zhuǎn)染。（二） rDNA導入大腸桿菌1. 氯化鈣轉(zhuǎn)化法感受態(tài)細胞2. 電穿孔法轉(zhuǎn)化效率高于方法 13. 體外包裝感染法適用于 λ 載體和柯斯質(zhì)粒（二） rDNA導入哺乳動物細胞1. DNA磷酸鈣共沉淀2. 病毒感染法3. 顯微注射法4. 脂質(zhì)體介導法五、轉(zhuǎn)化菌的篩選 （一） λ噬菌感染 ，形成很亮的噬菌斑， 溶源生長多少也有溶菌，形成噬菌斑挑選噬菌斑即可分析鑒定轉(zhuǎn)化子。 （二）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 可用含抗生素的平板篩選，挑選陽性克隆分析鑒定轉(zhuǎn)化子（圖 83）。六、 DNA重組體的篩選 轉(zhuǎn)化子不一定就是重組子。 轉(zhuǎn)化菌中有一部分是重組子，質(zhì)粒載體就是粘端基因的重組體，含有載體抗生素抗性基因，可在含抗生素平板上存活。 而酶切不完全或酶切后載體未與目的基因重組而自身環(huán)化導入host中去的另一部分就可能不是的，但因含抗生素抗性基因也可在抗生素平板上生長，所需要 rDNA篩選。確定外源 DNA片段是否插入并與載體連接。五 重組體的篩選與鑒定（一）遺傳學方法1. 抗生素抗性篩選（插入失活） 此法適用于帶有抗生素抗性標記基因的克隆載體， 將外源 DNA插入到 其一抗生素基因序列內(nèi)，該基因就失活，據(jù)此特性，設(shè)計一套藥物平板，可篩選出重組子。 插入失活應(yīng)用舉例 含 Ampr和 tetr,后者含 BamHI和 SalI 2個單一限制酶切點，具有 Ampr和 tetr表型。（雙抗） tetr任何一個酶切點插入外源基因片斷，都會導致tetr失活。 PBR322的細菌先涂布于含Amp的瓊脂板上，存活者必定是轉(zhuǎn)化子。（ Ampr） tet的瓊脂板上，對照 2個平板，凡在Amp平板上生長而在 tet上不生長的菌落，必定是帶有外源基因的重組子。五 重組體的篩選與鑒定（一）遺傳學方法2. 遺傳標記補救篩選 A 二氫葉酸還原酶（ DHFR)標記基因 用于外源基因?qū)氩溉閯游锛毎箨栃钥寺〉暮Y選。B. α －互補（藍白菌落篩選或稱 x－ gal篩選）⒈ 載體 Puc系列（ PUC18/19） 帶有 DNA的短區(qū)段，含： (1) Lacz(N)即編碼 β －半糖苷酸 N端的 146個 AA信息也稱α －多肽； (2)編碼區(qū)插入一個 MCS并不破壞閱讀框，使少數(shù)幾個 AA插入到 該酶的 N端而不影響其功能； (3)Plac可以啟動 Lacz的 轉(zhuǎn)錄，表達，但受阻 ， IPTG（異丙基硫代 β －半乳糖苷）能夠去阻遏。⒉JM103 受體菌含 lacz(c)可以編碼 β －半乳糖苷酶的 C端部分⒊α －互補 當載體轉(zhuǎn)入 JM103 lacz(n)與 lacz(c) α 互補，編碼具有活性酶 pr→ 使底物 Xgal生色（ 5溴 4氯 3吲哚 β －半乳糖苷產(chǎn)生蘭菌落）。⒋ 當 MCS插入外源 gene片斷時，幾乎無一例外產(chǎn)生無 α －互補能力的 氨基酸片段（插入酶失落）導致白菌落產(chǎn)生。PUC19PlacLacZ(N)MCSJM 103外源基因片段插入 白菌落IPTGlacz(c) Xgal 藍菌落β半乳糖苷酶圖 α互補①②③④C. 噬菌斑篩選 噬菌體系列載體包裝外源 DNA后的重組分子的長度必需是其野生型長度的 75%105%時，方能形成有活性的噬菌體顆粒，在培養(yǎng)平板上出現(xiàn)清晰的噬菌斑。 不含外源 DNA的單一載體 DNA因其長度太小不能被包裝成活的噬菌體顆粒，感染細菌后不形成噬菌斑。（二）免疫學方法 western blotting，檢測外源基因的表達產(chǎn)物。 （三）分子生物學方法1. 限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析基本流程是 : ⑴ 挑選平板轉(zhuǎn)化菌落 → 小量培養(yǎng) → 快速提取質(zhì)粒 . ⑵ 酶切 rDNA和載體對照電泳分析 → 即可判斷所選菌落是否含有重組 DNA分子 . EcoRIPBR325APOAIPUC19APOAI加樣孔 圖 pUC19APCAI和 pBR325APOAI質(zhì)粒 DNA及其 EcoRI酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖PUC192. 核酸探針雜交檢測法3. 聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR)4. 測序第五節(jié) 克隆基因的表達一、原核生物表達體系（一）大腸桿菌表達體系組成 1. 目的基因： 真核生物目的基因的cDNA (CDS)； 2. 載體 ： 大腸桿菌表達載體（包含三要素） 3. 受體菌株： 遺傳改造的基因工程菌 （二）、提高外源基因表達水平的策略1. 促進蛋白質(zhì)合成選用強啟動子。調(diào)整 SD序列和起始密碼子之間的距離。利用溫度敏感或藥物誘導啟動子來協(xié)調(diào)宿主菌的生長周期和表達周期。2. 抑制蛋白降解 融合蛋白表達。 使用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌突變體。 3. 維持和恢復(fù)蛋白質(zhì)特異空間結(jié)構(gòu)控制目的蛋白占總細菌蛋白的量，防止形成包涵體。 大腸桿菌表達體系 優(yōu)越性 ： 1. 對大腸桿菌的背景知識，特別是基因表達調(diào)控的分子機理有深刻的了解； 2. 是一種安全的基因工程實驗體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體； 3. 許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細胞中實現(xiàn)有效、高水平的表達； 4. 大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。大腸桿菌中表達體系的不足 ： 1. 真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很大的差別。 2. 真核基因的轉(zhuǎn)錄信號同原核的不同。 細菌的 RNA聚合酶不能識別真核的啟動子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號功能的核苷酸序列。 3. 真核基因 mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細菌的有所差異，影響真核基因 mRNA穩(wěn)定性。4. 許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類修飾作用在細菌細胞中并不存在；5. 細菌的蛋白酶，能夠識別外來的真核基因所表達的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。原核細胞表達載體pBV220 、 pET等 , 多種載體有商品化供應(yīng)原核細胞 RNA聚合酶可以識別的啟動子原核細胞轉(zhuǎn)錄終止子原核細胞核糖體結(jié)合位點 其他調(diào)控序列結(jié)構(gòu)特點克隆基因在原核生物中表達的必要條件是攜帶克隆基因的載體具備原核生物中所需要的以下表達調(diào)控序列 : 表達質(zhì)粒 載體 pET的結(jié)構(gòu) 適用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子蛋白，尤其那些空間結(jié)構(gòu)和生物學活性依賴于糖基化或磷酸化等修飾的蛋白質(zhì)。 常用的真核表達體系有酵母，昆蟲和哺乳類動物細胞等。二、真核生物表達體系（一）真核表達載體 主要包括質(zhì)粒載體和病毒載體，使用的調(diào)控表達元件最初多來源于病毒。SV40病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒載體腺相關(guān)病毒載體真核細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點優(yōu)點l重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞具有遺傳的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。l可表達需要翻譯后修飾的蛋白。l可表達基因組 DNA，也可表達 cDNA。l可表達分泌性蛋白。l蛋白產(chǎn)物對宿主細胞的影響不大，且自身也很少降解。缺點l表達系統(tǒng)相對復(fù)雜l成本高l生長周期長演講完畢，謝謝觀看！