【正文】 同聚物加尾連接： 利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈 DNA的 3′端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源 DNA和載體 DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸 dA(dG)和 dT(dC), 然后在 DNA連接酶的作用下 , 連接成為重組的 DNA。 基因工程－－第四章 基因操作過程 理想的酶切位點(diǎn)應(yīng)當(dāng)符合下列幾個(gè)條件 位于載體上的酶切位點(diǎn)要盡可能少，最好是單一的酶切位點(diǎn) 酶切位點(diǎn)前方要一個(gè)較強(qiáng)的啟動(dòng)子 選擇的載體必須在連接后對(duì)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中的編碼區(qū)讀框不改變 基因工程－－第四章 基因操作過程 外源 DNA與載體的連接方法 黏性末端連接法 平未端連接法 人工接頭連接法 同聚物加尾連接法 基因工程－－第四章 基因操作過程 1 黏性末端連接法 單酶切位點(diǎn)黏性末端連接法 基因工程－－第四章 基因操作過程 同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接 基因工程－－第四章 基因操作過程 同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接 基因工程－－第四章 基因操作過程 單酶切位點(diǎn)黏性末端連接法的缺點(diǎn) 自身環(huán)化 雙向插入 多拷貝插入 假陽性 基因工程－－第四章 基因操作過程 雙酶切片段的定向克隆 外源 DNA和載體 DNA經(jīng)過兩個(gè)限制性內(nèi)切酶切割后為非同源互補(bǔ)的黏性末端連接 外源 DNA和載體 DNA經(jīng)過兩個(gè)限制性內(nèi)切酶切割后一側(cè)產(chǎn)生的黏性末端，另一側(cè)產(chǎn)生平未端（可先生成黏性末端再補(bǔ)平） 基因工程－－第四章 基因操作過程 雙酶切片段的定向克隆的優(yōu)點(diǎn) 外源 DNA只能以一個(gè)方向定向插入到重組質(zhì)粒中，以便目的基因的正確轉(zhuǎn)錄和表達(dá) 載體與外源 DNA結(jié)合處的限制酶切位點(diǎn)仍然保留，可以隨時(shí)從重組載體中通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割后分離獲得目的基因 不會(huì)自身環(huán)化，轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌克隆大多數(shù)攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒 基因工程－－第四章 基因操作過程 不同粘性末端的連接 2 平末端的連接 基因工程－－第四章 基因操作過程 從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多 提高平頭末端連接效率的方法包括： 加大連接酶用量（ 10倍大于粘性末端的連接） 加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì) 加入 10% PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用 加入單價(jià)陽離子（ NaCl），最終濃度 150200 mM 基因工程－－第四章 基因操作過程 平末端的連接的優(yōu)點(diǎn) 適用于外源 DNA片段與載體只有一個(gè)匹配點(diǎn)，同時(shí)考慮靶基因插入方向時(shí)使用 靶基因以一個(gè)方向插入且非重組克隆背景低 可用 T4－ DNA ligase連接任何平末端 基因工程－－第四章 基因操作過程 3 人工接頭連接法 人工接頭 又稱銜接物、適配子，是人工合成的具有一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割序列的雙平端 DNA短序列，其分子長(zhǎng)度約為 8－ 12bp。 基因工程－－第四章 基因操作過程 提高重組率的方法 提高外源 DNA片段與載體的分子比 ： 5 : 1 10 : 1 載體 DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)： 基因工程－－第四章 基因操作過程 提高重組率的方法 加裝同聚尾末端： 基因工程－－第四章 基因操作過程 第二節(jié) 重組體導(dǎo)入 重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法 轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞 基因工程－－第四章 基因操作過程 1 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞 各種基因工程受體的特性 實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 基因工程－－第四章 基因操作過程 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 限制性缺陷型 外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（ recB， recC， hsdR） 重組整合缺陷型 用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞 （ recA） 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型 感染寄生缺陷型 防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染，生物武器除外 基因工程－－第四章 基因操作過程 各種基因工程受體的特性 大腸桿菌 遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，重組子穩(wěn)定 適用于外源 DNA的擴(kuò)增和克隆、原核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建，是 DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要受體菌 產(chǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素 基因工程－－第四章 基因操作過程 枯草桿菌 遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全 ，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，不產(chǎn)內(nèi)毒素 適用于原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌 遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備 基因工程－－第四章 基因操作過程 鏈霉菌 抗生素的主要生產(chǎn)者，分子遺傳相對(duì)操作簡(jiǎn)便，不產(chǎn)內(nèi)毒素 主要用于抗生素生產(chǎn)菌株的改良 遺傳不穩(wěn)定，生長(zhǎng)相對(duì)緩慢 基因工程－－第四章 基因操作過程 酵母菌 具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定 適用于外源 DNA的擴(kuò)增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的研究，是 DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程重要的真核性受體菌 內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高 基因工程－－第四章 基因操作過程 昆蟲細(xì)胞（家蠶） 具有真核生物的特征，外源基因表達(dá)量高，繁殖相對(duì)較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定 適用于真核生物基因的高效表達(dá) DNA重組操作系統(tǒng)欠完善 基因工程－－第四章 基因操作過程 哺乳動(dòng)物細(xì)胞（中國(guó) 倉鼠卵巢細(xì)胞 CHO） 與人的親緣關(guān)系近，分子重組表達(dá)系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng) 適用于哺乳類動(dòng)物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是 DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要哺乳動(dòng)物受體 細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)緩慢 基因工程－－第四章 基因操作過程 植物細(xì)胞（擬南芥、煙葉 ） 農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)意義重大，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞易于分化，細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)單且成本低廉，具有光合作用 遺傳操作繁瑣 基因工程－－第四章 基因操作過程 擬南芥（ Arabidopsis thaliana） 總狀花序頂生 花瓣 4片，白色，匙形 十字花科，二年生草本，高 7～ 40cm，植株小、每代時(shí)間短、結(jié)子多、生活力強(qiáng) 基因工程－－第四章 基因操作過程 擬南芥是進(jìn)行遺傳學(xué)研究的好材料 被科學(xué)家譽(yù)為“植物中的果蠅” 擬南芥的基因組是目前已知植物基因組中最小的 每個(gè)單倍染色體組（ n=5）的總長(zhǎng)只有 7000萬 bp 擬南芥是自花受粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型 基因工程－－第四章 基因操作過程 實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體 大腸桿菌 用于接受質(zhì)粒： C600、 W31 HB10 JM8JM101（ Aps、 Tcs、 Cms） 用于接受 lDNA： LE39 ED8654 酵母菌 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 CHO 畢赤酵母（ Pichia pastoris） 啤酒酵母 （ Saccharomyces cerevisiae ） 基因工程－－第四章 基因操作過程 克隆與導(dǎo)入方法： 轉(zhuǎn)化： 將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)菌細(xì)胞，使受體菌細(xì)胞遺傳性狀發(fā)生改變 轉(zhuǎn)染： 攜帶外源基因的病毒感染受體細(xì)胞的方法 電轉(zhuǎn)化： 受體細(xì)胞施加短暫的高壓電流，其質(zhì)膜上形成微孔，外源 DNA通過微孔進(jìn)入宿主細(xì)胞 基因槍法： 利用壓縮氣體動(dòng)力，產(chǎn)生的冷氣體沖擊波進(jìn)入轟擊室，把粘有 DNA的金粉打向細(xì)胞核。此組正常情況下在含抗生素的 LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn) 陰性對(duì)照 感受態(tài)細(xì)胞被有抗生素抗性菌株污染，可長(zhǎng)出菌落 選擇性平板失效，可長(zhǎng)出菌落 選擇性平板被有抗生素抗性菌株污染，可在平板邊緣或中間長(zhǎng)出菌落 基因工程－－第四章 基因操作過程 以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA溶液 ,但涂板時(shí)只取 5μl 菌液涂布于不含抗生素的 LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落 陽性對(duì)照 基因工程－－第四章 基因操作過程 ② 電穿孔轉(zhuǎn)化 將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；?DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中 ， 兩極施加高壓電場(chǎng) 。 ori Ap + Xgal 重組子（ Apr + lacZ） 將外源基因克隆在 pUC18的 lacZ′標(biāo)記 基因內(nèi)部 ， 使之滅活 ， 此時(shí)重組子呈 Apr、 lacZ， 白色菌落 ；而非重組子則呈 Apr、 lacZ+， 藍(lán)色菌落 基因工程－－第四章 基因操作過程 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與非轉(zhuǎn)化子，一般不能區(qū)分 重組子 與非重組子。 常用寡核苷酸探針的標(biāo)記物 放射性同位素標(biāo)記： 32P、 33P、 35S 非放射性標(biāo)記： 生物素、地高辛 生物素－ dUTP、生物素－ dATP、地高辛－ dUTP等 基因工程－－第四章 基因操作過程 雜交探針的標(biāo)記： ABC熒光標(biāo)記 基因工程－－第四章 基因操作過程 雜交探針的標(biāo)記： ABC顯色酶標(biāo)記 基因工程－－第四章 基因操作過程 地高辛－ dUTP 雜交探針的標(biāo)記： 地高辛系統(tǒng)標(biāo)記 基因工程－－第四章 基因操作過程 兩種地高辛－ dUTP顯色系統(tǒng) 基因工程－－第四章 基因操作過程 DIG探針雜交過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 雜交探針的制備： 用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件： 單鏈結(jié)構(gòu) （ 雙鏈 DNA可用堿變性 ） 足夠長(zhǎng)度 （ 至少 12個(gè) 堿基 ） 內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū) 探針的制備方法或來源包括： 人工合成 cDNA合成 同源序列 mRNA GACCTA AAGCGGATCG TAGGTC GACCTA CTGGAT A A G C T G G G C A 基因工程－－第四章 基因操作過程 T4PNP介導(dǎo)的末端標(biāo)記 探針的標(biāo)記方法 切口移位 (平移 )法 引物延伸法 末端標(biāo)記法 體外轉(zhuǎn)錄或反錄法 ① 末端標(biāo)記 TdT介導(dǎo)的末端標(biāo)記 T4Pol介導(dǎo)的末端標(biāo)記 基因工程－－第四章 基因操作過程 ② DNA聚合酶 介導(dǎo)的 切口平移 標(biāo)記 基因工程－－第四章 基因操作過程 ③ DNA聚合酶 介導(dǎo)的 隨機(jī)引物法 基因工程－－第四章 基因操作過程 ④ 逆轉(zhuǎn)錄酶 介導(dǎo)的 反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 3’ AAAAAAAAAAACCAGCTTCC 雙脫氧法測(cè)序 (Sanger dideoxy procedure ) ① 雙脫氧法測(cè)序 原理 基因工程－－第四章 基因操作過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 雙脫氧法測(cè)序基本過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 自動(dòng)測(cè)序電泳裝置 基因工程－－第四章 基因操作過程 An example of a portion of a chromatogram from automated sequencing Automated sequencing is based on the dideoxy methodology, but four different fluorescent dyelabelled ddNTPs are used. Thus each fluorescent label can be detected by its characteristic spectrum. The products are separated by automated electrophoresis and the bands detected by fluorescence spectroscopy. 基因工程－－第四章 基因操作過程 Sanger測(cè)序儀采用 96個(gè)毛細(xì)電泳管的陣列，可以同時(shí)進(jìn)行 96個(gè)這樣的測(cè)序反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)得到的 Read長(zhǎng)度可以達(dá)到 1000bp以上 MEGABACE1000 DNA測(cè)序 儀 基因工程－－第四章 基因操作過程 多道移液器 96孔反應(yīng)板 基因工程－－第四章 基因操作過程 ② 雙脫氧法測(cè)序 程序 將待測(cè)基因序列打斷成較短重