基因工程11大腸桿菌基因工程-全文預(yù)覽
【正文】 賴型的體內(nèi)重組： 基本形式 同源序列依賴型的體內(nèi)重組： 同源整合 ori 目的基因 同源區(qū)域 標(biāo)記基因 整合位點(diǎn) 染色體 DNA 同源序列依賴型的體內(nèi)重組： 同源交換 ori 目的基因 同源區(qū)域 標(biāo)記基因 交換區(qū)域 染色體 DNA ori 標(biāo)記基因 + 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 重組目的蛋白表達(dá)后都會(huì)面臨被降解的命運(yùn)。 以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 目的蛋白高效表達(dá) 在不提高質(zhì)粒拷貝數(shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)，可以在一定程度上改善表達(dá)量 穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽 短肽由于缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌細(xì)胞中的半衰期較短。純化后的融合蛋白用 Xa處理，即可獲得目的蛋白。 化學(xué)斷裂法： 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 單殘基位點(diǎn) 蛋白內(nèi)切酶 切割位點(diǎn) 梭菌蛋白酶 ArgC 葡萄球菌蛋白酶 GluC 假單孢菌蛋白酶 LysC 豬胰蛋白酶 ArgC LysC 蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高，斷裂位點(diǎn)專一性強(qiáng)。因此在生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。 目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲得目的蛋白。 以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳。 融合型異源蛋白的表達(dá) 將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，作為一個(gè) 開放閱讀框架 進(jìn)行表達(dá)。 目的蛋白易于分離 目的蛋白末端完整 真核生物成熟蛋白 N端并不含有甲硫氨酸殘基，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)， N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。 包涵體的溶解與變性： 主要任務(wù)是拆開錯(cuò)配的 二硫鍵 和 次級(jí)鍵； 在人工條件下使蛋白溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。而這是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的 Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過30%。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降 解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道 質(zhì)粒拷貝數(shù) 質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制 pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子 pCP3 PL MCS ori Apr 在 28℃ 時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為 60 在 42℃ 時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至 300 600 在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的 CI基 因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活 因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)粒拷 貝數(shù)和基因的表達(dá) C 大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 分泌型異源蛋白的表達(dá) 融合型異源蛋白的表達(dá) 寡聚型異源蛋白的表達(dá) 整合型異源蛋白的表達(dá) 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體及其性質(zhì) 在特定生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為 包涵體（ Inclusion Bodies，IB）。例如，在 人尿激酶原 cDNA的 412個(gè)密碼子中，共含有 22個(gè) 精氨酸密碼子 ，其中 7個(gè) AGG、 2個(gè) AGA， 而大腸桿菌受體細(xì)胞中 tRNAAGG和 tRNAAGA的豐度較低。 對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上還與 mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。 很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá) ， 其原因如下： ?轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA所需時(shí)間就相應(yīng)增加 ， 外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； ?如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域 ， 如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等 ， 則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它功能 ， 甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； ?過長(zhǎng)的 mRNA往往產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì) ， 增加工程菌無謂的能量消耗； ?過長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu) ， 大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率 強(qiáng)終止子的選擇與使用 目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌 rRNA操縱子上的 rrnT1T2以及 T7噬菌體 DNA上的 Tf。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu) 生物體對(duì)密碼子的偏愛性 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是： 生物基因組中的堿基含量 在富含 AT的生物（如單鏈 DNA噬菌體 fX174） 基因組中，密碼子第三位上的 U和 A出現(xiàn)的頻率較高；而在 GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有 G或 C的簡(jiǎn)并密碼子占 90%以上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì) 密碼子與反密碼子相互作用的自由能 如 GGG、 CCC、 GCG、GGC、 AAA、 UUU、 AUA、 UAU等使用少；如 GUG
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