基因工程3大腸桿菌表達系統(tǒng)-全文預覽
【正文】 UC、 UCA或AGG時，翻譯水平下降 20倍。例如，在大腸桿菌細胞中， 90%的外切核酸酶是RNaseII；而在枯草桿菌細胞中，占絕對優(yōu)勢的外切核酸酶是 PNPase 為了維護自身的穩(wěn)定性， mRNA 分子在進化過程中也形成了兩種保護性結構元件： 5’UTR系列和 3’UTR系列 以及 順反子間區(qū)（ intercistronic region）的莖環(huán)結構 。這種遺傳密碼使用的非隨機性現(xiàn)象 ——密碼子使用的偏愛性 。 3） 堿基含量（ AT/GC） （ 2）密碼子使用的偏愛性對基因表達效率的影響 ** 富含大腸桿菌罕見密碼子的外源真核基因是很難在大腸桿菌細胞中得到有效的表達。 影響大腸桿菌生理狀態(tài)的因素：包括培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、細胞培養(yǎng)方式、以及培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基中所溶解的氧等。 ** 到底多少含量的罕見密碼子才不會給克隆在大腸桿菌的外源基因的表達造成負面影響？ 機制還不明確。 實驗發(fā)現(xiàn)，密碼子第 3位結尾的嘧啶堿基在使用上是非隨機的，存在著偏愛性，且這種偏愛性與基因的表現(xiàn)度有關。 遺傳密碼子的使用對基因表達效率的影響 （ 1）密碼子使用的偏愛性 遺傳密碼有簡并性，即一種氨基酸有數(shù)個同義密碼子；例如，亮氨酸共有 6個密碼子。 在細菌細胞中，有兩類不同的核糖核酸酶參與 mRNA降解作用：核糖核酸內(nèi)切酶（ RNaseE、 RNaseK和RNaseIII）和核糖核酸外切酶（ RNaseII和 PNPase—polynucleotide phosphorylase）。 如果這個區(qū)域是由 4個 A或 4個 T堿基組成，其翻譯最有效；而當是由 4個 C或 4個G堿基組成，翻譯效率則只及最高翻譯效率的 50%或 25%。它包含 5’UAAGGAGG3’的全部或其中一部分。 大體步驟為：使攜帶目的基因的質(zhì)粒同時帶上編碼 ?啟動子的 ?cl基因，形成特殊的重組質(zhì)粒。 （ 2）質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性對表達效率的影響 質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性是指質(zhì)粒缺陷性分配引起的質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。 ColE1及其衍生質(zhì)粒的復制，受兩種負調(diào)節(jié)成分的控制： RNAI和 Rom蛋白質(zhì)。因此，增加 mRNA分子數(shù)量是提高克隆基因表達效率的有效途徑。還示出 pTR161質(zhì)粒的 8種派生質(zhì)粒的序列缺失程度。 此外， 兩個保守序列之間的距離也影響克隆基因的表達效率，這段間隔距離越接近于 17個堿基 ，啟動子的活性就越強。其中用得最多的是 缺失 lon蛋白酶 的大腸桿菌突變株。 pWT551和 pWT571 （ 4）分子伴侶 （ molecular chaperone） 穩(wěn)定作用 分子伴侶： 指一類多功能蛋白質(zhì)，它能夠通過阻止諸如聚合作用這樣的副反應，來促使其它蛋白質(zhì)按正確的方式折疊，而其本身卻不是最終形成的功能蛋白質(zhì)的組成成分。 167。 （ 2）結構決定因子與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 ? 與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關的確切的分子結構特征？ 不清楚 ? 但已經(jīng)明確了若干種影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的結構決定因子。 影響因素包括： （ 1）蛋白質(zhì)的降解作用 在大腸桿菌的細胞中，含有大量的各種類型的蛋白酶，廣泛分布在細胞質(zhì)、周質(zhì)、內(nèi)外膜等部位，參與許多方面的代謝活動，包括選擇性地酶解異常的蛋白質(zhì)。（ 原因：細胞周質(zhì)中蛋白酶的含量低 ） 到目前為止，這方面的技術還很不成熟，外泌率低。 如果在室溫下操作，轉化效率會大大降低。 ? 當電壓和電脈沖時間的一定方式組合而導致50%70%細菌死亡時，轉化效率達到最高。因此，只在極少數(shù)情況下才使用此法。 Hanahan轉化法 1983年由 Hanahan設計。 常用的大腸桿菌表達載體 迄今為止，基因工程學家已經(jīng)設計并構建了一系列的以原核啟動子取代真核啟動子的質(zhì)粒表達載體系統(tǒng)。 分子機制不明。 例如 : 在 RBS序列中增加 AT含量； 誘發(fā)特異堿基發(fā)生定點突變； 以及使用翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)進行克隆基因的表達。 —啟動子封堵作用 * 在克隆基因編碼區(qū)的 3’末端接上一個有效的轉錄終止子，便能夠阻止轉錄通讀。 2）這個啟動子應能呈現(xiàn)一種低限的基礎表達水平。 克隆基因正確表達的基本條件 最基本條件 ：應該能夠進行正常的轉錄和轉譯，以及在正常情況下還與轉譯后加工及新生多肽在細胞中的分布有關。 細菌的 RNA聚合酶不能識別真核的啟動子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉錄終止信號功能的核苷酸序列。但比較而言，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)越性。 ⑷ 表達產(chǎn)物容易分離純化。 ?基因高效表達研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個基
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