基因工程制藥新版(1)-全文預(yù)覽
【正文】 NA連接酶 15186。 linker的特性 其自身就可以形成互補(bǔ)雙鏈。 3180。 （ 3）載體、外源性 DNA均不產(chǎn)生自身環(huán)合現(xiàn)象 +線性聚合現(xiàn)象。 （ 3）將混合物進(jìn)行退火操作。 5180。 5180。 5180。 5180。 5180。 5180。 缺點(diǎn) 無法避免目的基因的自身環(huán)化 +目的基因的線性聚合現(xiàn)象。 （ 2）反應(yīng)過程中仍然會產(chǎn)生自身線性聚合體。 （ 3）方法 將外源 DNA、 pBR322同時用 HihdIII、 BamHI進(jìn)行切割，那末，外源性目的基因、 pBR322載體就會同時產(chǎn)生出 HihdIII粘性末端、 BamHI粘性末端。 優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 比較 簡單 ，容易操作。 （一）、插入滅活法 定義與方法 例子 優(yōu)缺點(diǎn) 定義與方法 定義 將外源性基因插入到載體的選擇性基因區(qū)域（標(biāo)記區(qū)域）、并使這一選擇性標(biāo)記區(qū)域失活的連接法，稱為 插入滅活法 。 粘接法 具有互補(bǔ)粘性末端的目的基因，與載體DNA，在 DNA連接酶的作用下，通過形成共價鍵結(jié)合，稱為粘結(jié)法。 差異展示 PCR法（ DDPCR) 原理：將具有兩組細(xì)胞在某一條件下可表達(dá)的 mRNA 群體通過逆轉(zhuǎn)錄方法變成相應(yīng)的 cDNA 群體，以此為模板，利用一對特殊引物，在一定條件下進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到與 mRNA相對應(yīng)的 DNA。 ? 鳥槍法的難點(diǎn) 必須有一種有效的目的基因檢測方法，常用 mRNA作為探針，進(jìn)行原位雜交法檢驗(yàn)。 ↓ 將每一片段和載體進(jìn)行重組。除掉未結(jié)合的非特異性 cDNA。 此法對分離基因 5’端十分有利，而基因5’端常是最難克隆的。 用罕見的限制酶切酵母人工染色體 DNA，酶切片斷連上泡狀接頭，用泡狀引物和 Alu特異引物 PCR擴(kuò)增。 選泡狀接頭及泡狀引物是為了保證 PCR反應(yīng)的選擇性。 ? CpG島是很多基因 5’端的標(biāo)志。 PCR的反應(yīng)體系 （ 1） 變性 ，加熱至 95 ℃ ，使模板 DNA解開成單鏈； （ 2） 退火 ，溫度降至適宜，使引物與模板互補(bǔ)結(jié)合； （ 3） 延伸 ，溫度升至 72 ℃ ， DNA聚合酶以 4種 dNTP為底物，在引物的 3’OH上，合成與模板互補(bǔ)的DNA新鏈。 RTPCR技術(shù)法 1985， PCR發(fā)明以后， RTPCR得到了廣泛的應(yīng)用。以便于使得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)。 非表達(dá)型 是指重組后插入的 cDNA不能經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯，合成蛋白質(zhì)。 然后，再以 cDNA第一鏈為模板，在 DNA聚合酶的作用下，合成 DNA互補(bǔ)雙鏈。 經(jīng)過 23次寡聚脫氧胸腺苷酸 Oligo dT纖維素柱之后，就可得到較高純度的 mRNA。 （ 3）逆轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的 DNA的特性 （ A）只反映 mRNA經(jīng)過加工之后的 基因編碼序列 ，而不象真核生物的原始 DNA那樣具有復(fù)雜的信息承載。 （ 2）逆轉(zhuǎn)錄法的理論依據(jù) 逆轉(zhuǎn)錄法就是從mRNA→cDNA→DNA→mRNA→Protein的方法。 （ 3）化學(xué)合成法的實(shí)例 訖今為止，通過化學(xué)合成方法已經(jīng)了近百種產(chǎn)物的基因。 （ 2）合成片段越長、分離純化越困難、產(chǎn)率越低 。 1976年 . Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想，并于 1979年在 science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。 物理學(xué)密度梯度離心法 不同 DNA片段，其密度不同，借此進(jìn)行密度梯度離心，實(shí)現(xiàn)分離。 DNA經(jīng)過直接用酶切割、或者機(jī)械破碎之后，可產(chǎn)生編碼不同基因的DNA片段，由于不同基因中的 GC堿基對含量、與 AT堿基對含量有差異，結(jié)果就導(dǎo)致它們之間的密度不同，因此通過 分離技術(shù) +觀察技術(shù) +鑒定技術(shù) 結(jié)合，就能將其分離。 病毒 DNA的提取 用少量 λ 噬菌體感染宿主，然后用大量的培養(yǎng)基進(jìn)行感染細(xì)菌的培養(yǎng)，最后全部細(xì)菌都會被λ 噬菌體感染。 ↓ 最后采用氯化銫（ CsCl2）進(jìn)行密度梯度離心法分離。 細(xì)菌染色體 DNA的提取 采用凍融、溶菌酶、 EDTA處理、去垢劑處理使得細(xì)胞裂解。 凝膠電泳法。 分離方法 是指從大分子的混合物中分離出DNA。 提取方法 （ 1）機(jī)械法 破壞細(xì)胞，釋放出 DNA。第三節(jié) 基因工程制藥生產(chǎn)的基本過程 一、工具酶的分離純化 二、載體的分離純化 三、外源 DNA和目的基因的分離和獲得 四、外源 DNA與載體 DNA的切割與連接 五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮? 六、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長代謝的特點(diǎn) 七、基因工程菌中試 八、基因工程菌的擴(kuò)增和發(fā)酵生產(chǎn) 九、基因工程藥物的分離和純化技術(shù) 十、變性蛋白的復(fù)性 十一、基因工程藥物的質(zhì)量控制 十二、基因工程藥物的制造實(shí)例 三、外源 DNA和目的基因的分離和獲得 （一）基本操作方法 （二）不同類別 DNA的提取技術(shù) （三）目的基因的制備 （一）基本操作方法 細(xì)胞內(nèi)的 DNA大多與 RNA及蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，需要經(jīng)過提取、分離、純化，才能獲得高純度的 DNA。 （ 3）使用核酸酶抑制劑（檸檬酸、砷酸鹽、 EDTA）以防止 DNA被酶解。 （ 4）用酚、去垢劑使蛋白質(zhì)變性 除去蛋白質(zhì)，剩下 DNA。 純化方法 分子篩層析法。從而可以分離 。 ↓ 含 DNA的水相用 乙醇沉淀 ，以獲得 絲狀的 DNA沉淀物， ↓ 沉淀物用緩沖液透析，除掉去垢劑和有機(jī)溶劑。 要防止低分子量的 DNA的污染。 需要克
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