基因工程制藥新版(2)-全文預覽
【正文】 ampR和 tetR抗性基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點，供外源基因插入 當外源基因插入抗藥基因內(nèi)，抗藥基因失活。必須具備以下條件： （ 1）其分子結(jié)構(gòu)中必須具有多個單一 限制酶的切割位點 。 單鏈切割 連接 單鏈切割 連接 共價閉合環(huán)形 DNA （ SC型） 開環(huán) DNA （ oc型） 線性 DNA （ L型） 環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒 DNA分子具有三種不同構(gòu)型 （ 3）質(zhì)粒的分類 F質(zhì)粒 可使宿主 A的部分基因隨著 F質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)移到不存在該質(zhì)粒的另一宿主 B的體內(nèi)。 質(zhì)粒的復制類型 ◆ 嚴謹型（ strigent plasmid)： 復制與宿主染色體同步受宿主染色體復制的限制，在宿主細胞中拷貝數(shù)低約 １～３份拷貝 。 能夠進行 自我復制 。 （ 12）所產(chǎn)生的 mRNA必須具有翻譯的起始信號，即含有起始密碼 AUG和 SD序列，以便轉(zhuǎn)錄之后能夠順利于進行翻譯。 （ 8）應具有靈活的 克隆位點 、并且有方便的 篩選標記 。 （ 4）在宿主體內(nèi)，能夠控制外源基因的表達活動。 二、基因工程載體的分離純化 （一）定義 （二）基因工程載體的必備條件 （三）基因工程載體的種類 （一）定義 能夠?qū)⒛康幕?攜帶 進宿主細胞、并可使得目的基因能夠在宿主體內(nèi)進行 自主性復制 的遺傳因子，稱為基因工程載體。 （ 2）損傷 DNA的修復。 EcoRI HindIII BamHI PstI SstI SalI AvaI BclI HindII HpaI BglII ClaI HaeIII HhaI HinfI HpaII MboI SmaI XbaI XhoI 影響限制酶作用的因素 （ 1） DNA的純度 （ 2） DNA的甲基化程度 （ 3） DNA的結(jié)構(gòu) （ 4）反應的溫度 最適溫度為 37度 （ 5）反應的緩沖體系 反應體系中通常含有MgCl NaCl、 KCl、 β 巰基乙醇、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白。 （ 3）構(gòu)建基因文庫。 能夠形成固定的核苷酸單鏈末端。限制酶分為三個類型： （ 1） Ⅰ 型限制酶 由于其切點不固定，很難形成特異性的切割末端。 ※ EcoB(大腸桿菌 B株 )的核酸酶不能識別已甲基化 的序列。第三節(jié) 基因工程制藥生產(chǎn)的基本過程 一、工具酶的分離純化 二、載體的分離純化 三、外源 DNA和目的基因的分離和獲得 四、外源 DNA與載體 DNA的切割與連接 五、宿主細胞的選擇和基因?qū)氩僮? 六、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長代謝的特點 七、基因工程菌中試 八、基因工程菌的擴增和發(fā)酵生產(chǎn) 九、基因工程藥物的分離和純化技術(shù) 十、變性蛋白的復性 十一、基因工程藥物的質(zhì)量控制 十二、基因工程藥物的制造實例 血紅蛋白基因 血紅蛋白基因排列順序 血紅蛋白的結(jié)構(gòu) 血紅蛋白的運送氧氣功能 血紅蛋白的基因工程流程 一、工具酶的分離純化 （一）基因工程制藥所用到的工具酶 （二）關(guān)于限制酶 （三）關(guān)于連接酶 （一）基因工程制藥所用到的工具酶 限制性內(nèi)切酶 甲基化酶 Klenow聚合酶 T4DNA聚合酶 T4多核苷酸激酶 堿性磷酸酶 核酸酶 S1 核酸酶 Bal31 綠豆核酸酶 核糖核酸酶 人外切核酸酶 DNA酶 1 外切 RNA酶 III 外切 RNA酶 VI DNA聚合酶 1 T4DNA連接酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 T4RNA連接酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 大腸桿菌 DNA連接酶 （二）關(guān)于限制酶 宿主限制現(xiàn)象 限制酶的定義 限制酶的特征 限制酶的作用 基因工程所用到的限制酶 影響限制酶作用的因素 宿主限制現(xiàn)象 病毒或噬菌體在 宿主 A細胞中生長良好 ,但在 宿主 B細胞中生長很差 ,原因是它的 DNA受到宿主 B的限制 ,這種現(xiàn)象是 宿主控制性限制 （ restriction）與修飾 (modification) ,簡稱（ R/M體系）。而 DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在 EcoB甲基化酶的作用下，催化 S腺苷甲硫氨酸（ SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。 限制酶的定義 凡是能夠 識別和切割 DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶稱為限制酶。 限制酶的特征 具有專一性的識別位點。 （ 2）構(gòu)建新載體。 基因工程所用到的限制酶 通常是 Ⅱ 型限制酶 ，具體有以下幾種。 作用 主要用于 （ 1）正常 DNA的合成。 （ 3 T4RNA連接酶 催化單鏈 DNA或 RNA的 5‘磷酸與另一單鏈 DNA或 RNA的 3’羥基之間形成共價連接。 （ 3）載體在攜帶目的基因之后，還
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