《基因工程》ppt課件-全文預覽
【正文】 組 cDNA的克隆群體。 ? 染色劑 溴化乙錠 (EB) 吖叮橙 EB可檢測到 ng級的 DNA， 熒光強度與 DNA數(shù)量成正比 27 操作過程 28 29 DNA分子大小的檢測 NEB， 1Kb DNA Ladder： 3kb=， 1kb= PCR產(chǎn)物 3Kb 1Kb 30 第三節(jié) 核酸的分子雜交 ? 雜交的基本原理：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等），可按堿基互補原則退火形成雙鏈 . ， 1975 31 ? 類似于 DNA的體內(nèi)復制。 電泳緩沖液還有一個組分是 EDTA， 加入濃度為 12mmol/L，目的是螯合 Mg2+ 等離子，防止電泳時激活 DNA酶，此外還可防止 Mg2+離子與核酸生成沉淀。 緩沖液在電泳過程中的一個作用是維持合適的 pH。 ssDNA: 1A260 ≈ 37ug/ml 。 17 ? cDNA第二鏈的合成方法－ 置換合成法 ? 利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈，不用堿變性（水解mRNA），而是在 dNTPs存在下， 利用 RNA酶 H在雜交鏈的 mRNA鏈上造成切口和缺口。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過 異丙醇沉淀 來還原。 ※ 異硫氰酸胍 屬于解偶劑，是一類強力的 蛋白質(zhì)變性劑 ，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，導致細胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。 8 一般步驟 : (1) 破碎細胞，裂解細胞壁 機械方法 : 超聲波處理、研磨、 勻漿 化學方法 : SDS（ 陰離子去垢劑 ） EDTA，使得 DNase失活 (why?) 酶學方法 : 溶菌酶或蝸牛酶 (2) 通過蛋白質(zhì)變性 或分解，使 DNA游離出來 (3) 分離 DNA 9 2. cDNA的分離與純化 （ 1）總 RNA 的提取 ? RNase，不需輔助因子，耐酸堿，分布極廣 ? RNase的來源 外源：操作者，實驗器皿，試劑，空氣 內(nèi)源：不同組織和細胞數(shù)量不同 ? 創(chuàng)造無 RNase的環(huán)境 — DEPC(焦碳酸二乙酯 )（配成 %的 DEPC 水） — 異硫氰酸胍 ? Trizol試劑 10 逆轉(zhuǎn)錄過程中 cDNA的合成 依賴 RNA的DNA聚合酶 核糖核酸酶H活力 依賴 DNA的DNA聚合酶 11 Trizol試劑 Trizol的主要成分是 苯酚 。 7 1. 基因組 DNA的分離與純化 ? DNA主要存在于細胞核的染色體中。 4 基因工程的操作過程 酶切 連接 轉(zhuǎn)化 擴增 檢測 目的基因的獲取 克隆載體的構(gòu)建 外源基因與載體的連接 （ 體外重組） 重組 DNA導入受體菌 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定 克隆基因的表達 5 目的 基因的克?。? ? 基因工程或 DNA重組技術(shù)的前提條件是從生物體中分離克隆目的基因。 ? 也稱為 分子克隆技術(shù) , 基因克隆或基因工程 ? 供體 、 受體 、 載體 是重組 DNA技術(shù)的三大基本元素。 ? 核酸樣品的質(zhì)量將直接關系到實驗的成敗。 排除其它分子的污染 。 12
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