《基因工程》ppt課件(文件)
【正文】 粒 DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； ? 當(dāng)用 堿處理 DNA溶液時(shí)，線(xiàn)狀染色體 DNA容易發(fā)生變性， 共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA在回到中性 pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； ? 變性染色體 DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的 超螺旋質(zhì)粒 DNA分子 則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。 寡聚核苷酸 ： 1A260 ≈ 30ug/ml。一個(gè)好的緩沖系統(tǒng)應(yīng)有較強(qiáng)的緩沖能力，使溶液兩極的 pH保持基本不變。 便于加樣 。 ? 這種 熱變性 復(fù)性 延伸 的過(guò)程 就是一個(gè) PCR循環(huán)， PCR就 是這種循環(huán)的不斷重復(fù)。 ? 功能 ：運(yùn)送外源基因 高效轉(zhuǎn)入受體 細(xì)胞；為外源基因 提供復(fù)制能力或整合能力 ；為外源基因的 擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件 ? 常用載體 ： 克隆載體，表達(dá)載體 如：質(zhì)粒載體，噬菌體載體， YAC，動(dòng)植物病毒等。 47 5. 重組 DNA分子的轉(zhuǎn)化 ? 轉(zhuǎn)化 是指將質(zhì)?；蚱渌庠?DNA導(dǎo)入處于 感受態(tài)的 宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過(guò)程。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（ MCS），它并不破壞讀碼框（ ORF），可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到 β半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能。 53 由 α互補(bǔ)而產(chǎn)生的 LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑 IPTG的作用下，在生色底物 XGal存在時(shí)產(chǎn)生 藍(lán)色菌落 ，因而易于識(shí)別。 ? 如果一個(gè)哺乳動(dòng)物的基因組是 3 109堿基對(duì)，直接從細(xì)胞中提取并分離出某一特定基因的 DNA片段在技術(shù)上是很困難的。在不同的表達(dá)系統(tǒng)中，其表達(dá)方式不盡相同。 58 基因工程的主要目的之一，就是要制備大量有用的蛋白質(zhì)和多肽，尤其是人體蛋白。這種重組子的篩選，又稱(chēng)為 藍(lán)白斑篩選 。 因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。 ? 增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序。 39 質(zhì)粒載體 ? ori 復(fù)制起點(diǎn) ? MCS 多克隆位點(diǎn) ? Ampr 氨芐青霉素抗性基因 ? LacZ’ β半乳糖苷酶基因的部分序列 ? P 啟動(dòng)子 Ampr lacZ’ MCS PT7 ori PSP6 pGEM3z 40 PGEMT載體圖譜 41 4. DNA的 體外重組 42 EcoRⅠ 5‘ … … 3’ 3‘ … … 5’ ? 回文序列 palindromic seq 限制性核酸內(nèi)切酶 43 Sma I CCCGGG GGGCCC CCC GGG GGG CCC ? 粘性末端 cohensive end ? 平末端 blunt end 44 常見(jiàn)的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn) 45 DNA連接酶（ DNA ligase） ? DNA連接酶催化雙鏈 DNA一端 3ˊOH與另一雙鏈 DNA的 5ˊ端磷酸根 形成 3ˊ→5ˊ 磷酸二酯鍵，使具有相同粘性末端或平端的 DNA兩端連接起來(lái)。 34 35 ? 基因組 DNA文庫(kù)， Genomic libraries : 含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組 DNA克隆群體； ? cDNA文庫(kù)， cDNA libraries： 是指含有所有重
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