《基因工程的概念》ppt課件(文件)
【正文】 氯霉素不能結合在核糖體上。該蛋白質可分為兩部分： α鏈和 β鏈。這兩個基因（ LacZ和 LacZα）均可作為標記基因。次克隆(subcloning)或限制酶譜分析；外源 DNA擴增。 具有兩種抗菌素抗性基因可供轉化子的選擇記號。 （ 3）、多克隆位點區(qū)（ MCS） 由人工合成的多個單一酶切位點構成。mRNA生存時間短 ， 技術要求高 由氨基酸序列合成 據(jù)推測出的核苷酸序列，通過化學方法合成 專一性最強 ，目的基因不含內含子 ，可合成自然界不存在的基因 目前 ， 復雜的尚不知核苷酸序列的基因不能合成 供體細胞中 DNA 限制性酶 運載體 DNA片段 不同受體細胞 DNA片段擴增 找出 目的基因細胞 目的基因 mRNA 逆轉錄 單鏈 DNA 合成 雙鏈 DNA 獲取目的基因的方法 重組 DNA操作過程示意圖 Cloning Strategies for Identifying Specific Genes 。 其 MCS區(qū)與 M13mp噬菌體載體的相同，可使 pUC上克隆的目的基因直接轉移到 M13mp載體，進行 DNA測序和體外突變等研究。 pB R32 2B a m HIS a l IH i n d I I IP s t IS c a I A m pro r i(4. 36 k b) Vectors 利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程 BamHI片段 (Tcr) pBR322 PstI(Apr)片段 重組分子 I 重組分子 Ⅱ (Aps Tcr) (Apr Tcs） PstI片段 外源 DNA BamHI片段 重組分子 I 涂布 Ap平板 Apr轉化子 分別轉化 (ApS TcS) 重組分子 Ⅱ 涂布 Tc平板 Tcr轉化 子 影印到 Tc平板上 Apr TcS為重組 子 Apr Tcr為原載體 影印到 Ap平板上 ApS Tcr為重組子 即為非重組 子 篩選重組子的示意圖 重組D N AA m prTcs提取D N A 電泳A m prA m prA m prA m prTcrTcrTcA m prTcsTcs轉化 無菌落陽性菌落篩選重組子2 ) D N A 重組無D N A 插入有D N A 插入外源D N A1 ) 限制酶切 pUC18和 pUC19 pUC系列質粒載體具有三個顯著特點： （ 1）、分子量更小，僅為 ，容納外源 DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（不用氯霉素擴增，每個細胞含 500700個拷貝）。 上述兩例中的非重組子來源有兩個： a. 酶切反應時仍未被作用的 pBR322或 pUC18分子 b. 酶切后的載體分子經(jīng)自我連接又形成載體分子 Vectors pB R32 2B a m HIS a l IH i n d I I IP s t IS c a I A m pro r i(4. 36 k b)E c o S ac Kp n S m a B am X b a S al P s t S p h Hi nRI I I I HI I I I I d I I IpU C 1 8pU C 1 9Hi n S p h P s t S al Xba B am S m a K p n S ac E c od I I I I I I I HI I I I RIApO r iL a c Z( 8kb )rpUC18和 pUC19載體 普通型載體 pBR322的結構圖 （ 2）、 表達型載體（ expression vector） 1) 特點 : a. 基因的啟動子序列和終止子序列； b. 一般無檢測標記基因； c. 克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）； d. 重組分子用凝膠電泳檢出（依賴于分子量差異）。 β— 半乳糖苷酶基因的優(yōu)點 : a. 酶催化 XGal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀 b. lacZα編碼 5‘端可容許很大的變化（如加入多克隆位點）而不影響酶活性 c. lacZα和 β鏈基因的分別表達可使載體小而容量大 P LacZα LacZβ 轉錄 翻譯 α β LacZ基因的結構與產(chǎn)物 pUC18 BamHI片段 重組 DNA分子 轉化 外源 DNA BamHI片段 涂布在含 XGal 和 Ap的平板上 , 白色菌落為重組 子， 蘭色菌落 為 原載體 利用 LacZ基因篩選重組子 （四）、質粒載體的類型 根據(jù)載體的分子生物學特性劃分 （ 1） . 質粒型載體 — 環(huán)狀 dsDNA分子，自主復制 （ 2） . 病毒型載體 — 環(huán)狀、線狀、 ss和 dsDNA分子，形成病毒顆粒 （ 3） .混合型載體 — 具質粒和病毒特性，特性的轉換依賴于宿主細胞生物學特性 Vectors 根據(jù)載體功能劃分 （ 1） . 普通型載體 1) 特點 : 至少有一個以上的克隆位點和兩個標記基因，其中一 個用于轉化體選擇，另一個用于重組子檢測。這兩個部分可獨立存在， 分別由兩個基因編碼。Kanr等 抗性基因均可使這類抗生素 磷酸化 ，使之不能進入細胞內。Apr抗性基因編碼一種分泌到細菌細胞周間質的酶，可特異地 切割 氨芐青霉素的 β— 內酰胺環(huán)，使氨芐青霉素失活。有的基因是不能用作選擇性標記基因（ lacZ等）。 pB R32 2B a m HIS a l IH i n d I I IP s t IS c a I A m pro r i(4. 36 k b)（三）遺傳標記基因 標記基因的作用
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