《基因工程載體》ppt課件 (2)(文件)
【正文】 互補(bǔ)，白菌斑。 ② 選擇方便 Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。 不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的。SP01噬菌體 DNA中沒(méi)有 T堿基，取代的是 5羥甲基尿嘧啶（ HMU）。 ?DNA兩端各有 12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱(chēng)為 cos位點(diǎn)。 這種多聯(lián)體分子必須在 cos位點(diǎn)被切斷成單體分子才能被包裝起來(lái)。 （ 5）可產(chǎn)生大量的含有外源 DNA插入片 斷的 單鏈分子 ，便于作探針或測(cè)序。 成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也容易提取。 （ 2） DNA長(zhǎng)度 （ 3） DNA提純 （ 1）寄主 M13序列 （ 4） M13的生活周期 雖然不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長(zhǎng)變慢，約為正常的 1/2— 3/4） M13通過(guò)雄性細(xì)菌的 F性須 注入其 +DNA +DNA合成－ DNA，形成 RF dsDNA － DNA轉(zhuǎn)錄 mRNA、 合成 +DNA、翻譯形成噬菌體蛋白 組裝成新的噬菌體 M13， 擠出寄主細(xì)胞 +DNA DNA mRNA M13外殼蛋白 組裝成子代 M13 +DNA 注入大腸桿菌 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 翻譯 +DNA 指導(dǎo)合成 +DNA 200個(gè) RF DNA 每個(gè)細(xì)胞可以放出約 1000個(gè) M13顆粒 ！ 3. M13載體的構(gòu)建： M13基因組中只有基因 II與基因 IV之間存在一段 507bp的基因間隔區(qū)。 在 IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的 LacZ’（ ?肽序列 )。 頭部包含線(xiàn)狀染色體 DNA，侵染寄主時(shí)將自己的 DNA注入寄主細(xì)菌 。而攜帶了原噬菌體 的細(xì)菌被稱(chēng)為溶源菌 （ lysogen ） 。 當(dāng)其注入到寄主細(xì)胞中后 ， 可以迅速通過(guò)這兩個(gè)粘性末端的互補(bǔ)作用形成雙鏈的環(huán)形 DNA分子 。 大量游離的正鏈DNA很快參入到外殼蛋白中形成了大量新的噬菌體顆粒 。 第二節(jié) 噬菌體載體 一、 ?噬菌體 二、 M13噬菌體 1 M13噬菌體的生物學(xué)特征 2 M13噬菌體的侵染 3 M13噬菌體的載體 1. M13噬菌體的生物學(xué)特性 M13是線(xiàn)狀的大腸桿菌噬菌體 ， 顆粒內(nèi)含有 6 047bp的閉合環(huán)狀單鏈 DNA基因組 ， 相對(duì)小 ， 意味著可供插入的外源 DNA 的空間小 。至少包括 61個(gè)基因 ， 其中一部分為噬菌體生命活動(dòng)的必須基因 ， 另一部分 （ b2區(qū) ） 可以被外源基因取代而不會(huì)影響到噬菌體的正常功能 。 ?噬菌體的侵染 ?噬菌體的侵染是 溶源侵染，是噬菌體 DNA分子在宿主細(xì)胞中能夠穩(wěn)定存在，許多 噬菌體 DNA能 整合到寄主細(xì)胞染色體上并可以隨著寄主細(xì)胞的分裂而進(jìn)行復(fù)制。 （ 2）加入酶切位點(diǎn) ① 在 IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點(diǎn) 第一個(gè) M13載體： M13mp1： M13 RF BsuI不完全消化 各種長(zhǎng)度的線(xiàn)性片斷 （其中應(yīng)有只在IG上切開(kāi)的線(xiàn)性全長(zhǎng) M13） lac基因的HindII片斷 (lacI、lacP、 lacO、 lacZ’） 連接 M13mp1 JM101宿主 只有在 IG區(qū)插入 lacZ’才能存活并現(xiàn)在 Xgal上出互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑 與 pUC18相同 M13mp18的多克隆位點(diǎn) 4. M13系列載體的優(yōu)點(diǎn) （ 1）有 MCS，便于克隆不同的酶切片段 （ 2） Xgal顯色反應(yīng)，可供直接選擇 （ 3）無(wú)包裝限制，克隆能力大 （ 4）可以克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈 子代 M13噬菌體中包含的是單鏈 +DNA。 其余 9個(gè) BsuI限制性位點(diǎn)分布在其它部位。 但 M13 DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。（ ssDNA） （ 4）不存在包裝限制。 1. 單鏈 DNA噬菌體的特點(diǎn) （ 3） RF DNA和 ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài) 大腸桿菌。 3. ?DNA的復(fù)制 模型 （ 1） ?型復(fù)制 （ 2）滾環(huán)復(fù)制 感染的晚期：?jiǎn)?dòng)滾環(huán)復(fù)制機(jī)制。 烈
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