《基因工程載體》ppt課件 (2)(文件)
【正文】 互補，白菌斑。 ② 選擇方便 Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。 不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的。SP01噬菌體 DNA中沒有 T堿基，取代的是 5羥甲基尿嘧啶（ HMU）。 ?DNA兩端各有 12bp的粘性末端，粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為 cos位點。 這種多聯(lián)體分子必須在 cos位點被切斷成單體分子才能被包裝起來。 （ 5）可產(chǎn)生大量的含有外源 DNA插入片 斷的 單鏈分子 ，便于作探針或測序。 成熟的噬菌體里只包裝有 + DNA，也容易提取。 （ 2） DNA長度 （ 3） DNA提純 （ 1）寄主 M13序列 （ 4） M13的生活周期 雖然不導致溶菌，但使菌斑混濁（細菌生長變慢，約為正常的 1/2— 3/4） M13通過雄性細菌的 F性須 注入其 +DNA +DNA合成－ DNA，形成 RF dsDNA － DNA轉(zhuǎn)錄 mRNA、 合成 +DNA、翻譯形成噬菌體蛋白 組裝成新的噬菌體 M13， 擠出寄主細胞 +DNA DNA mRNA M13外殼蛋白 組裝成子代 M13 +DNA 注入大腸桿菌 復制 轉(zhuǎn)錄 翻譯 +DNA 指導合成 +DNA 200個 RF DNA 每個細胞可以放出約 1000個 M13顆粒 ！ 3. M13載體的構(gòu)建： M13基因組中只有基因 II與基因 IV之間存在一段 507bp的基因間隔區(qū)。 在 IG區(qū)內(nèi)插入一個大腸桿菌的 LacZ’（ ?肽序列 )。 頭部包含線狀染色體 DNA，侵染寄主時將自己的 DNA注入寄主細菌 。而攜帶了原噬菌體 的細菌被稱為溶源菌 （ lysogen ） 。 當其注入到寄主細胞中后 ， 可以迅速通過這兩個粘性末端的互補作用形成雙鏈的環(huán)形 DNA分子 。 大量游離的正鏈DNA很快參入到外殼蛋白中形成了大量新的噬菌體顆粒 。 第二節(jié) 噬菌體載體 一、 ?噬菌體 二、 M13噬菌體 1 M13噬菌體的生物學特征 2 M13噬菌體的侵染 3 M13噬菌體的載體 1. M13噬菌體的生物學特性 M13是線狀的大腸桿菌噬菌體 ， 顆粒內(nèi)含有 6 047bp的閉合環(huán)狀單鏈 DNA基因組 ， 相對小 ， 意味著可供插入的外源 DNA 的空間小 。至少包括 61個基因 ， 其中一部分為噬菌體生命活動的必須基因 ， 另一部分 （ b2區(qū) ） 可以被外源基因取代而不會影響到噬菌體的正常功能 。 ?噬菌體的侵染 ?噬菌體的侵染是 溶源侵染，是噬菌體 DNA分子在宿主細胞中能夠穩(wěn)定存在，許多 噬菌體 DNA能 整合到寄主細胞染色體上并可以隨著寄主細胞的分裂而進行復制。 （ 2）加入酶切位點 ① 在 IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點 第一個 M13載體： M13mp1： M13 RF BsuI不完全消化 各種長度的線性片斷 （其中應有只在IG上切開的線性全長 M13） lac基因的HindII片斷 (lacI、lacP、 lacO、 lacZ’） 連接 M13mp1 JM101宿主 只有在 IG區(qū)插入 lacZ’才能存活并現(xiàn)在 Xgal上出互補的藍噬菌斑 與 pUC18相同 M13mp18的多克隆位點 4. M13系列載體的優(yōu)點 （ 1）有 MCS，便于克隆不同的酶切片段 （ 2） Xgal顯色反應，可供直接選擇 （ 3）無包裝限制，克隆能力大 （ 4）可以克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈 子代 M13噬菌體中包含的是單鏈 +DNA。 其余 9個 BsuI限制性位點分布在其它部位。 但 M13 DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。（ ssDNA） （ 4）不存在包裝限制。 1. 單鏈 DNA噬菌體的特點 （ 3） RF DNA和 ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài) 大腸桿菌。 3. ?DNA的復制 模型 （ 1） ?型復制 （ 2）滾環(huán)復制 感染的晚期：啟動滾環(huán)復制機制。 烈
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