基因工程載體ppt課件(2)-資料下載頁
2025-09-11 18:25本頁面
【正文】 以放出約 1000個 M13顆粒 ！ 3. M13載體的構建： M13基因組中只有基因 II與基因 IV之間存在一段 507bp的基因間隔區(qū)。 （ 1）克隆區(qū)域的選定 ① 基因間隔區(qū)（ intergenic region, IG區(qū)） IG區(qū)內只有一個 BsuI 切點。 其余 9個 BsuI限制性位點分布在其它部位。 ② 酶切位點 M13 J. Messing證明， IG區(qū)存在 M13的 復制起點 ，但可以插入外源 DNA而不影響 M13噬菌體的活力。 在 IG區(qū)內插入一個大腸桿菌的 LacZ’（ ?肽序列 )。 利用 ?肽序列中的三個單一酶切位點（ Bgl II、 Ava II 和 Pvu I）。 （ 2）加入酶切位點 ① 在 IG區(qū)內加入單一內切酶位點 第一個 M13載體： M13mp1： M13 RF BsuI不完全消化 各種長度的線性片斷 （其中應有只在IG上切開的線性全長 M13） lac基因的HindII片斷 (lacI、lacP、 lacO、 lacZ’） 連接 M13mp1 JM101宿主 只有在 IG區(qū)插入 lacZ’才能存活并現(xiàn)在 Xgal上出互補的藍噬菌斑 與 pUC18相同 M13mp18的多克隆位點 4. M13系列載體的優(yōu)點 （ 1）有 MCS，便于克隆不同的酶切片段 （ 2） Xgal顯色反應，可供直接選擇 （ 3）無包裝限制，克隆能力大 （ 4）可以克隆雙鏈 DNA分子中的每一條鏈 子代 M13噬菌體中包含的是單鏈 +DNA。 1 生物學特征 2 ?噬菌體的侵染 3 ?噬菌體的 DNA分子 ?噬菌體的生物學特性 ?噬菌體由正二十面體的蛋白質頭部和中空管狀的蛋白質尾部組成 。 頭部包含線狀染色體 DNA，侵染寄主時將自己的 DNA注入寄主細菌 。 ?噬菌體屬 溫和噬菌體 。 ?噬菌體的侵染 ?噬菌體的侵染是 溶源侵染，是噬菌體 DNA分子在宿主細胞中能夠穩(wěn)定存在，許多 噬菌體 DNA能 整合到寄主細胞染色體上并可以隨著寄主細胞的分裂而進行復制。 在溶源性細菌內存在的整合或非整合的噬菌體 DNA被稱為原噬菌體 （ prophage ） 。而攜帶了原噬菌體 的細菌被稱為溶源菌 （ lysogen ） 。 ? 噬 菌 體 的 侵 染 ?噬菌體的 DNA分子 ?DNA的分子為 49kb, 大多數基因已經測序和定位 。至少包括 61個基因 ， 其中一部分為噬菌體生命活動的必須基因 ， 另一部分 （ b2區(qū) ） 可以被外源基因取代而不會影響到噬菌體的正常功能 。 ?噬菌體的 DNA分子 ?DNA在分子兩端各有 12個堿基的單鏈互補粘性末端 。 當其注入到寄主細胞中后 ， 可以迅速通過這兩個粘性末端的互補作用形成雙鏈的環(huán)形 DNA分子 。 上述通過粘性末端互補形成的雙鏈區(qū)被稱為 cos位點 （ cohesive end site） .另外的作用是內切核酸酶的識別序列 。 第二節(jié) 噬菌體載體 一、 ?噬菌體 二、 M13噬菌體 1 M13噬菌體的生物學特征 2 M13噬菌體的侵染 3 M13噬菌體的載體 1. M13噬菌體的生物學特性 M13是線狀的大腸桿菌噬菌體 ， 顆粒內含有 6 047bp的閉合環(huán)狀單鏈 DNA基因組 ， 相對小 ， 意味著可供插入的外源 DNA 的空間小 。 M13單鏈 DNA的復制型 （ RF， replicative form） 是呈雙鏈環(huán)形 ， 此時的 DNA， 不會插入細菌基因組 ， 持續(xù)復制 ， 當積累到 100200個拷貝后 ， 噬菌體 DNA編碼的正鏈特異結合蛋白很快就阻止了負鏈的進一步生成 ， 但以負鏈為模板的正鏈合成并未受到影響 。 大量游離的正鏈DNA很快參入到外殼蛋白中形成了大量新的噬菌體顆粒 。 M13 噬 菌 體 的 侵 染
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