【正文】 改造的猴腎病毒 SV40 痘苗病毒 皰疹病毒 昆蟲桿狀病毒 應(yīng)用動(dòng)物病毒弱毒或無毒株 : （四）考斯質(zhì)粒與噬菌粒 ?DNA和 M13DNA載體的最大裝載量分別為 25kb和 ， 但很多情況下 ， 往往需要克隆更大的外源 DNA片段 。 考斯質(zhì)粒和噬菌粒的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體 DNA的裝載量。 構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路 。 在包裝上限固定的條件下 ， 大幅度縮短噬菌體 DNA的長度 ， 就能同步增加載體的裝載能力 。 將 噬菌體 DNA包裝有關(guān)序列 與 質(zhì)粒 組裝在一起 ， 既能縮短載體長度 、 提高裝載量 ， 又能保證重組 DNA在體外仍被包裝成有感染性的顆粒 。 由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒 不攜帶包裝蛋白基因 ， 因此重組 DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒 。 考斯質(zhì)粒（ Cosmid） cos pHC79 kb Tetr 包裝相關(guān)序列 ori Ampr Pst I BamH I Sal I 1978年， ＆ 發(fā)明構(gòu)建 考斯質(zhì)粒： 是一類人工構(gòu)建的含有 ?DNA的 cos序列 、 包裝相關(guān)序列 + pBR322質(zhì)粒的復(fù)制子 、克隆位點(diǎn) 、 標(biāo)記基因的特殊類型載體； kb的 ?DNA片段 +pBR322片段； kb， 裝載范圍為 3145 kb。 cos site carrying plasmid； 考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)： 能像 ?DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染 ； 裝載量大（ 45 kb） ； 能像質(zhì)粒那樣在 ； 制備與質(zhì)粒相同， 重組操作簡便，篩選容易 ； 與 ?DNA不同：不能體內(nèi)包裝，不裂解 。 Cosmid克隆的過程 用 CIP去除線性載體的 5’P， 可防止載體自連 。 ? 噬菌粒（ phagemid） 是一類人工構(gòu)建的含 單鏈?zhǔn)删w 包裝序列 、 復(fù)制子和 質(zhì)粒 復(fù)制子 、 克隆位點(diǎn) 、標(biāo)記基因的特殊類型載體 。 噬菌粒的特點(diǎn)： 能像 M13DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染 ； 裝載量比 M13mp系列大得多 （ 10 kb） ； 能像質(zhì)粒那樣在 ； 重組操作簡便，篩選容易。 通過克隆雙鏈 DNA，能獲得同等長度的單一單鏈DNA； 重要的噬菌粒載體 pUC118/119 = pUC18/19的 ori、 Ampr、 lacZ’、 MCS + M13IG、 ori 3200 bp MCS lacZ’ lacI ori Ampr M13IG pUC118/119 pUC118/119： 1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式 在宿主細(xì)胞沒有感染上 M13輔助噬菌體時(shí) ， 受 pUC本身的復(fù)制起點(diǎn)控制 ， 每個(gè)細(xì)胞能達(dá) 500個(gè)拷貝 。 500 個(gè)拷貝 2）單鏈?zhǔn)删w滾環(huán)復(fù)制模式 當(dāng)宿主細(xì)胞被 M13輔助噬菌體感染后 ，受 M13的復(fù)制起點(diǎn)控制 ， 按單鏈?zhǔn)删w滾環(huán)復(fù)制模式復(fù)制 。 表示 M13輔助噬菌體 DNA 輔助噬菌體： 自身 ori突變 、 復(fù)制效率低 ， 但感染宿主細(xì)胞后 ， 能表達(dá)出外殼蛋白和復(fù)制蛋白 ， 幫助噬菌粒載體復(fù)制 ， 如 M13K07。 表示 M13輔助噬菌體 DNA 3）噬菌粒載體的包裝 高效復(fù)制的噬菌粒單鏈 DNA被包裝成噬菌體顆粒，被擠出宿主細(xì)胞外。 表示 M13輔助噬菌體 DNA 人工染色體載體 人類 、 動(dòng)物 、 植物的全基因組序列分析需克隆數(shù)百甚至上千 kb DNA片段 ， 此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量遠(yuǎn)不能滿足需要 。 細(xì)菌人工染色體 酵母人工染色體 將 細(xì)菌 接合因子或 酵母 染色體的復(fù)制區(qū) 、分配區(qū) 、 穩(wěn)定區(qū)與 質(zhì)粒 組裝在一起 ， 即構(gòu)成 人工染色體載體 (artificial chromosome)。 當(dāng)大片段外源 DNA克隆在人工染色體載體上 ， 便形成重組人工染色體 ， 它能像天然染色體那樣 ， 在受體細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制并遺傳 。 細(xì)菌人工染色體 （ bacterial artificial chromosome, BAC） 1992年 ， F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的 ， 裝載量 50300kb； BAC在 單一拷貝 。 裝載量大，為 300 kb； BAC的特點(diǎn)： 單拷貝復(fù)制； 可以像提取質(zhì)粒一樣直接提取克隆的 DNA。 在細(xì)菌細(xì)胞中擴(kuò)增； CMR：氯霉素抗性基因； parA、 parB：控制拷貝數(shù)； oriS、 repE：復(fù)制起點(diǎn)，控制質(zhì)粒單向復(fù)制； oriS、 repE、 parA、 parB來自性因子； Not I：用于切下外源 DNA。 Hind III和 BamH I：克隆位點(diǎn)； BAC的組成： BAC主要適用于： 克隆大型基因簇（ gene cluster） ； 構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫（ gene library or gene bank）。 酵母人工染色體 （ yeast artificial chromosome, YAC） 1983年， ； 1987年， 。 按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建； 特點(diǎn)： 在酵母細(xì)胞中擴(kuò)增。 裝載量大，為 350400kb； 染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件： DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ ori） 著絲粒（ centromere） 兩個(gè)端粒（ telomeres） YAC載體應(yīng)含有下列元件： 酵母染色體的復(fù)制起點(diǎn) ARS 酵母染色體的著絲粒 CEN4 酵母染色體的端粒 TEL 酵母篩選標(biāo)記 TRP1 酵母篩選標(biāo)記 URA3 ori Ampr CEN4 pYAC4 EcoR I URA3 TEL BamH I TEL ori Ampr TRP1 ARS1 TRP1： 色氨酸生物合成基因 URA3： 尿嘧啶生物合成基因 YAC載體的使用： pYAC4 CEN EcoR I URA TEL BamH I TEL ori Ampr TRP ARS EcoR I EcoR I EcoR I BamH I 連接 轉(zhuǎn)化酵母菌 重組酵母染色體 幾種載體的最大裝載量： 15 kb 25 kb 45 kb 300 kb 400 kb plasmid ?DNA Cosmid BAC YAC 構(gòu)建其 cDNA文庫： 構(gòu)建其基因組文庫： 構(gòu)建動(dòng)、植物和人類大型基因組文庫： 絕大多數(shù)真核生物 mRNA 10 kb： 載體常選 ?DNA、 Cosmid； 載體選 plasmid； 載體選 BAC或 YAC。