基因的克隆方法ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-01-08 00:31本頁(yè)面
【正文】 33 （ 1）提取基因組 total RNA （ 2）反轉(zhuǎn)錄合成總 cDNA作模板 （ 4） PCR擴(kuò)增及序列分析 （ 3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物 2） 從 mRNA中擴(kuò)增 : RTPCR 原核生物不易得到 mRNA，也不含有polyA尾。 適合擴(kuò)增真核生物基因。 34 4 、 基于基因圖譜的基因克隆方法 ?又稱圖位克隆法，是建立在擁有 RFLP等分子標(biāo)記的連鎖遺傳圖和基因文庫(kù)，基因產(chǎn)物未知的一種基因克隆技術(shù)，理論上可以分離任何一個(gè)突變基因。 35 染色體 分子標(biāo)記 A 分子標(biāo)記 B 目的基因 陽(yáng)性克隆 轉(zhuǎn)化互補(bǔ)實(shí)驗(yàn) 基因圖位克隆示意圖 36 圖位克隆基因的一般操作過(guò)程： ?通過(guò)遺傳分析構(gòu)建與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記連鎖圖，達(dá)到基因的精細(xì)定位。 ?用與目標(biāo)基因緊密連鎖的兩側(cè)分子標(biāo)記 篩選基因組文庫(kù) ，構(gòu)建包含目標(biāo)基因的基因組物理圖譜。 目的基因 標(biāo)記 1 標(biāo)記 2 標(biāo)記 3 標(biāo)記 4 標(biāo)記 5 37 染色體 分子標(biāo)記 2 分子標(biāo)記 3 目的基因 基因組物理圖譜 進(jìn)一步精細(xì)定位 獲得目的基因 38 ?通過(guò)染色體步移或染色體登陸技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行進(jìn)一步精細(xì)定位，得到陽(yáng)性克隆。 ?對(duì)陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化隱性受體進(jìn)行功能互補(bǔ)。 ?基因序列測(cè)定及表達(dá)分析等。 39 ?影響基因圖位克隆的因素： ?建立的分子標(biāo)記遺傳圖中標(biāo)記與基因之間的距離大小。 ?基因組的大小及可能存在的大量的重復(fù)序列。 ?基因組文庫(kù)的大小及單克隆的大小。 ?成功的例子： ?水稻 Xa21 ?擬南芥的 RPM1， RPS2等。 40 ?圖位克隆基因需滿足的條件： ?較理想的遺傳圖譜和物理圖譜，如SSR、 RFLP圖譜。 ?大片段的基因組文庫(kù)（ BAC ， PAC ，TAC等）。 ?遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。 41 其它的基因克隆法 cDNA捕捉法 RNAi： RNA干涉法 酵母雙雜交法 。 42 思考題 ?請(qǐng)簡(jiǎn)單闡述 SH在 mRNA水平上克隆差異表達(dá)基因的機(jī)理。
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