【正文】 escript PT3 噬菌體啟動(dòng)子 PT3和 PT7強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄 提取出來的單鏈 DNA重組分子 在噬菌體 RNA聚合酶的存在下，又可實(shí)現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄 人造染色體載體 將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源 DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。 目前常用的人造染色體載體包括： 細(xì)菌人造染色體（ BAC） 酵母人造染色體（ YAC） 1983年形成基礎(chǔ)理論 , 1987年變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。 酵母人工染色體 1. YAC的特點(diǎn)： （ 1）只能在酵母細(xì)胞中擴(kuò)增。 （ yeast artificial chromosome, YAC) （ 2）克隆容量大，為 230kb1700kb。 （ 3）構(gòu)建原理，按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建。 （ 1） DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ ori） 2. 染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件： TEL TEL CEN ORI （ 2）著絲粒（ centromere， cen） （ 3）兩個(gè)端粒（ telomeres， tel） （ 1）著絲粒區(qū)（ CEN） A A GTCACGTG T TGTTTCTGNTTTCCGAAA 3. YAC的組成結(jié)構(gòu) 酵母染色體著絲粒區(qū)的保守序列 : 7886bp I II III 由三個(gè)區(qū)組成 酵母端粒保守序列是 (G4T2)n 重復(fù)序列。 （ 3）復(fù)制起點(diǎn)（ ORI） 約 100bp的自主復(fù)制序列（ ARS）。 （ 2）端粒（ TEL） 人是 TTAGGG重復(fù)序列 。 四膜蟲是 GGGTTG重復(fù)序列。 （真核生物中只有酵母菌有 ARS） 兩個(gè)端粒序列 Tel。 位于 SUP4 基因內(nèi)部。 （ 4）克隆位點(diǎn) 插入失活選擇： SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色； 不失活的菌落是白色。 TRP URA3（分別位于兩臂）。 細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn) ori和抗生素標(biāo)記 Ampr （ 5）在酵母中的標(biāo)記基因 （ 6）在細(xì)菌中操作 URA3:尿嘧啶合成缺陷基因 TRP1：色氨基酸缺陷基因 YAC載體應(yīng)含有下列元件： 酵母染色體的端粒序列 酵母人造染色體的構(gòu)建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色體的復(fù)制子 酵母染色體的中心粒序列 酵母系統(tǒng)的 選擇標(biāo)記 大腸桿菌的復(fù)制子 大腸桿菌的 選擇標(biāo)記 YAC載體的裝載量為 350 400 kb 酵母人造染色體的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 連接 轉(zhuǎn)化酵母菌 重組酵母染色體 著絲粒 端粒 自主復(fù)制因子 標(biāo)記基因 標(biāo)記基因 H. Shizuya等在大腸桿菌 F因子基礎(chǔ)上構(gòu)建的。 （ 2）克隆容量可達(dá) 300kb。 細(xì)菌人工染色體（ BAC） 1. F質(zhì)粒的特點(diǎn)： 每細(xì)胞只有一個(gè)拷貝，不會(huì)重組。 （ 4）便于提純 像提取質(zhì)粒一樣直接提純。 （ 1）單拷貝復(fù)制。 （ 3）比較穩(wěn)定。 BAC的組成結(jié)構(gòu) （ 1） OriS和 repE控制質(zhì)粒的單向復(fù)制。 （ 2） parA和 parB維持低水平質(zhì)?？截悢?shù)。 （ 3） CosN是噬菌體末端酶專一性切割位點(diǎn)。 （ 4） loxP是 P1 Cre蛋白作用位點(diǎn)。 （ 5） HindIII和 BamHI是插入位點(diǎn)。 （ 6）兩側(cè)的 NotI可用于切下外源 DNA。 （ 7）氯霉素抗性基因 CMR ? 表達(dá)載體 外源基因在宿主中高效表達(dá)的原理 啟動(dòng)子 終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 密碼子 質(zhì)粒拷貝數(shù) 載體表達(dá)出的外源基因蛋白質(zhì)不與細(xì)菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。 SD序列 ATG外源基因 TAG 優(yōu)點(diǎn) 1. 非融合型表達(dá)載體 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。 缺點(diǎn)： 容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。 pKK2233 ： 4584bp，使用的啟動(dòng)子： tac 強(qiáng)啟動(dòng)子，雜合啟動(dòng)子 trplac ；終止子： 5SrRNA 區(qū)域（ rrnB 操縱子區(qū)域）， rrnBT 和 rrnBT2 終止子（ 防止通讀）。受 lac 阻抑物調(diào)控， 15mM IPTG 誘導(dǎo)。 可直接表達(dá)任何含 RBS 和 ATG 的基因，若無 RBS，其 ATG 需與固有 RBS相隔 513bp 表達(dá)出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。 ①啟動(dòng)子： tac ② 操縱基因： lacP ③ 調(diào)節(jié)基因： lacI ④ SD序列 2. 融合蛋白表達(dá)載體系統(tǒng) （ 1）優(yōu)點(diǎn) （ 2）組成結(jié)構(gòu) 便于融合蛋白的分離和純化。 pGEX系列 lacI tac lac O SD/ATG GST 插入位點(diǎn) TGA lacP ⑤ ori： pBR322 ori ⑥ 融合肽： GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶） GST融合蛋白用 Glutathione Sepharose親和層析柱分離純化。 （ 3）產(chǎn)物提純 （ 4）產(chǎn)物分離 用凝血酶或 Xa因子可以把外源蛋白從 GST上切下來。 柱（ column） GST 外源蛋白 凝血酶 外源蛋白 柱（ column） GST GST 洗脫 柱（ column） 可再利用 pGEX 插入?yún)^(qū)： pGEX1lT CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGA Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr Asp EcoR I BamH I 凝血酶 PQE系統(tǒng)： Histag（組氨酸標(biāo)簽）： 在外源多肽的 N端或 C端接上 6個(gè)組氨酸（ His）。 Histag能與 Ni2+柱結(jié)合，但很容易被 EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。