真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌的表達(dá)載體克隆的真核-資料下載頁
2025-07-20 04:11本頁面
【正文】 腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。 （可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)） 優(yōu)點(diǎn)： 1. 蛋白質(zhì)的酶解作用程度低 2. 由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類少，因此目標(biāo)蛋白容易純化 3. 增進(jìn)了蛋白質(zhì)的折疊作用 4. 蛋白質(zhì) N末端的結(jié)構(gòu)真實(shí) 缺點(diǎn)： 1. 在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源真核蛋白質(zhì)，通常是不會(huì)分泌到胞外培養(yǎng)基中去的 2. 由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)相當(dāng)稀釋，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化過程比較復(fù)雜 融合蛋白質(zhì)的表達(dá) 融合基因：通常是指通過自發(fā)突變事件形成的、或是應(yīng)用 DNA重組技術(shù)構(gòu)建的、一類具有來自兩個(gè)或兩個(gè)以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。 由 DNA體外重組構(gòu)成的融合基因有兩種類型 一、由報(bào)告基因的編碼序列區(qū)和另一個(gè) 基因的啟動(dòng)子及其調(diào)節(jié)序列構(gòu)成的 二、由一種異源蛋白質(zhì)基因的編碼序列 區(qū)同寄主細(xì)胞的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成 融合蛋白質(zhì)：由克隆在一起的兩個(gè)或數(shù)個(gè)不同基因的編碼序列組成的融合基因，轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的單一的多肽序列。它們的功能往往是異常的，或者是已經(jīng)發(fā)生了變化。 融合蛋白質(zhì)的純化 基本原理： 利用與融合蛋白質(zhì) 配偶體 相對(duì)應(yīng)的配體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白質(zhì)被滯留下來，其它蛋白質(zhì)則流出駐外，經(jīng)洗脫處理，便可回收到純化的融合蛋白質(zhì)。 融合蛋白質(zhì)的切割 將其中大腸桿菌多肽組分切除掉。 ： 能特異性的從甲硫氨酸殘基處切割多肽鏈。 2. 胰蛋白酶切割法： 能從精氨酸或是賴氨酸殘基羧基一側(cè)進(jìn)行特異性的切割。 3. Xa切割法： 能唯一地從特異識(shí)別序列 C－末端切割多肽 影響克隆基因在大腸桿菌中的 表達(dá)效率因素 1. 5’UTR對(duì)克隆基因表達(dá)效率的影響 a. 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響 大腸桿菌啟動(dòng)子的保守序－ 35區(qū)（ 5’TTGACA）和－ 10(5’TATAAT)區(qū) 。它們之間的距離 (17bp)。 b. 啟動(dòng)子與克隆基因的間隔距離對(duì)表達(dá)效率的影響 當(dāng) mRNA分子 5’－末端與 SD序列之間的長(zhǎng)度小于 15bp時(shí)，轉(zhuǎn)譯效率下降。 2. 質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性對(duì)基因表達(dá)效率的影響 a. 質(zhì)粒載體點(diǎn)的拷貝數(shù)對(duì)表達(dá)效率的影響 b. 質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響 率的影響 a. 轉(zhuǎn)譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響 SD序列后面的 4個(gè)堿基， T或 A時(shí)轉(zhuǎn)譯作用較高， C或 G時(shí)，下降 50%或 25%； 位于起始密碼子 AUG上游的密碼三聯(lián)體的堿基， CUU或 UAU時(shí)轉(zhuǎn)譯效率最有效， UUC、 UCA或 AGG時(shí)下降 20倍； 位于起始密碼子 AUG下游的密碼子堿基組成，也影響轉(zhuǎn)譯的速率。 b. mRNA的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響 a. 密碼子使用的偏愛性現(xiàn)象的規(guī)律性 ?幾乎在所有的簡(jiǎn)并密碼子家族中，都有一個(gè)或兩個(gè)是優(yōu)先使用的偏愛性密碼子； ? 一些密碼子在各種不同基因中都是最常用的（在編碼脯氨酸 4種同義密碼子， CCC是優(yōu)先使用的） ? 高表達(dá)活性的基因比低表達(dá)活性的基因，呈現(xiàn)出較高程度的密碼子偏愛性 ? 簡(jiǎn)并密碼子的使用頻率，反應(yīng)它們相應(yīng)的 tRNA豐度。 響 富含大腸桿菌罕用密碼子的外源真核基因，很難在大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞中得到有效的表達(dá)。 不同生物密碼子的偏愛性，是阻礙外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的一種重要因素。 5. 寄主細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)基因表達(dá)效率的影響 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)方式、培養(yǎng)溫度等環(huán)境因素能影響大腸桿菌生理狀態(tài)。
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