【正文】 增，形成單克隆的 DNA簇，隨后將 DNA簇線性化。在下一步合成反響中，參加改造過的 DNA聚合酶和帶有 4種熒光標(biāo)記的 dNTP〔對硫磷〕。在 DNA合成時，每一個核苷酸加到引物末端時都會釋放焦磷酸鹽，激發(fā)生物發(fā)光蛋白發(fā)出熒光。用激光掃描反響板外表，在讀取每條模板序列第一輪反響所聚合上去的核苷酸種類后，將這些熒光集團化學(xué)切割，恢復(fù) 3`端黏性，隨后添加第二個核苷酸。如此重復(fù)，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，就可以得知每個模板 DNA片段的序列。 (知道 ) 第七十四頁，共九十一頁。 測序步驟： 測序文庫的構(gòu)建 錨定橋接 預(yù)擴 增 單堿基 延伸測序 數(shù)據(jù)分 析 第七十五頁，共九十一頁。 添加接頭：利用物理方法將待測樣品 DNA打碎，在單鏈DNA碎片兩端加上接頭。 第七十六頁，共九十一頁。 外表結(jié)合： Solexa的測序時利用微注射系統(tǒng)將已經(jīng)加過接頭和待測片段隨機添加到玻璃 Flow Cell內(nèi)，每一個Flow Cell又被分成 8條 Lane，每條 Lane的內(nèi)外表上能以共價鍵的形式隨機固定單鏈接頭序列和帶接頭的單鏈待測DNA片段。 第七十七頁，共九十一頁。 所有單鏈橋型待測片段擴增成雙鏈橋片段，通過變性，釋放出互補的單鏈，錨定到附近的固相外表。通過不斷循環(huán)，將會在Flow Cell的固相外表上獲得上萬條成簇分布的雙鏈待測片段。 第七十八頁，共九十一頁。 參加DNA聚合酶和被熒光標(biāo)記的dNTP和接頭引物進(jìn)行擴增，在每一個測序簇延伸互補鏈時，每參加一個被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相應(yīng)的熒光，測序儀通過捕獲熒光信號，并通過計算機將光信號轉(zhuǎn)化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。 第七十九頁，共九十一頁。 Solexa技術(shù)特點： 技術(shù)優(yōu)勢：測序性價比最高，運行本錢低； 可擴展的高通量； 需要樣品量少； 簡單、快速、自動化 誤差來源：每次添加核苷酸之前對熒光信號的切割，如果切割不完全，產(chǎn)生誤差。 〔知道〕 第八十頁，共九十一頁。 、第三代測序技術(shù)： Heliscope單分子測序儀 原理：將基因組 DNA切割成隨機的小片段 DNA分子并且在每個片段末端加上polyA〔多聚腺嘌呤核糖核苷酸〕尾巴。通過 polyA和固定在芯片上的 polyT雜交，將待測模板固定到芯片上，制成測序芯片。最后借助聚合酶將熒光標(biāo)記的單核苷酸摻入到引物上，采集熒光信號。之后切除熒光標(biāo)記基團，進(jìn)行下一輪測序反響，如此反復(fù)，最終獲得完整的序列信息。 〔知道〕 第八十一頁，共九十一頁。 步驟： 隨即打碎待測片段， 3’末端加上 Poly〔 A〕 末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上 Cy3熒光標(biāo)記 用小片段與外表帶有寡聚 Poly〔 T〕的平板雜交 參加 DNA聚合酶和 Cy5熒光標(biāo)記的 dNTP〔對硫磷〕進(jìn)行 DNA合成反響，每一輪反響參加一種 dNTP。 洗脫未參與合成的 dNTP和 DNA聚合酶，檢測雜交位置的熒光信號 化學(xué)試劑去熒光標(biāo)記 重復(fù)合成、洗脫、成像、猝滅過程，完成測試。 〔知道〕 第八十二頁，共九十一頁。 Heli Scope的優(yōu)勢： 單分子測序減少了試劑的使用，測序本錢價格大大降低。 不需要擴增建立 DNA庫，從而減少誤差。 第八十三頁，共九十一頁。 、第三代測序方法： SMRT法 原理： SMRT芯片是一種帶有很多 ZMW(zeromode waveguides)孔的厚度為100 nm的金屬片。將 DNA聚合酶、待測序列和不同熒光標(biāo)記的 dNTP放入ZMW孔的底部，進(jìn)行合成反響 。當(dāng)一個 dNTP被添加到合成鏈上的同時，它會進(jìn)入 ZMW孔的熒光信號檢測區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類就可以判定 dNTP的種類。在下一個 dNTP被添加到合成鏈之前，這個dNTP的磷酸基團會被氟聚合物〔 fluoropolymer〕切割并釋放，熒光分子離開熒光信號檢測區(qū)。 〔知道〕 第八十四頁，共九十一頁。 SMRT測序流程 第八十五頁，共九十一頁。 SMRT測序的特點及優(yōu)勢： 特點：邊測序變合成，熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團而不是堿基。 優(yōu)勢： 速度很快，利用這種技術(shù)測序速度可以到達(dá)每秒 10個 dNTP 。 信號強度大。由于 dNTP在熒光信號檢測區(qū)停留的時間〔毫秒級〕與它進(jìn)入和離開的時間〔微秒級〕 相比會很長，所以信號強度會很大。 第八十六頁，共九十一頁。 第三代測序方法：納米孔單分子法 Oxford NanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子技術(shù)是一種基于電信號測序的技術(shù)。他們設(shè)計了一種以 α溶血素為材料制作的納米孔，在孔內(nèi)共價結(jié)合有分子接頭環(huán)糊精。用核酸外切酶切割 ssDNA〔單鏈 DNA〕時，被切下來的單個堿基會落入納米孔，并和納米孔內(nèi)的環(huán)糊精相互作用，短暫地影響流過納米孔的電流強度，這種電流強度的變化幅度就成為每種堿基的特征。堿基在納米孔內(nèi)的平均停留時間是毫秒級的，它的解離速率常數(shù)與電壓有關(guān)， 180 mV的電壓就能夠保證在電信號記錄后將堿基從納米孔中去除。而且納米孔單分子技術(shù)可直接讀取甲基化的胞嘧啶，而不像傳統(tǒng)方法那樣必須要用重亞硫酸鹽處理。該技術(shù)尚處于研發(fā)階段，目前面面臨的兩大問題是尋找適宜的外切酶載體和承載納米孔平臺的材料。 〔了解〕 第八十七頁，共九十一頁。 納米孔單分子法示意圖 第八十八頁，共九十一頁。 納米孔單分子測序的特點： 準(zhǔn)確度高，納米孔單分子技術(shù)準(zhǔn)確率能到達(dá) %，且一旦發(fā)現(xiàn)替換錯誤也能較容易地更改?！惨驗?4種堿基中的 2種與另外 2種的電信號差異很明顯，因此只需在與檢測到的信號相符的 2種堿基中做出判斷，就可修正錯誤?！? 另外由于每次只測定一個核苷酸因此該方法可以很容易地解決同聚物長度的測量問題。 不需要熒光標(biāo)記。 面臨問題：尋找適宜的外切酶載體以及承載納米孔平臺的材料 第八十九頁，共九十一頁。 謝謝觀看 第九十頁，共九十一頁。 內(nèi)容總結(jié) 主要通過檢測什么檢測大腸桿菌：。?；撬崮軌蚴辜?xì)胞聚集從而改善檢測靈敏度 ,將少量的牛磺酸添加到懸浮液中。 2% RNase去除剖 (體積比 ):使用娃哈哈純潔水稀釋 RNase去除刻 ,用于芯片及 PCR耗材清潔。 末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上 Cy3熒光標(biāo)記。優(yōu)勢： 速度很快，利用這種技術(shù)測序速度可以到達(dá)每秒 10個 dNTP。謝謝觀看 第九十一頁，共九十一頁。