【正文】 增，形成單克隆的 DNA簇，隨后將 DNA簇線性化。在下一步合成反響中，參加改造過(guò)的 DNA聚合酶和帶有 4種熒光標(biāo)記的 dNTP〔對(duì)硫磷〕。在 DNA合成時(shí)，每一個(gè)核苷酸加到引物末端時(shí)都會(huì)釋放焦磷酸鹽，激發(fā)生物發(fā)光蛋白發(fā)出熒光。用激光掃描反響板外表，在讀取每條模板序列第一輪反響所聚合上去的核苷酸種類后，將這些熒光集團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù) 3`端黏性，隨后添加第二個(gè)核苷酸。如此重復(fù)，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板 DNA片段的序列。 (知道 ) 第七十四頁(yè)，共九十一頁(yè)。 測(cè)序步驟： 測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建 錨定橋接 預(yù)擴(kuò) 增 單堿基 延伸測(cè)序 數(shù)據(jù)分 析 第七十五頁(yè)，共九十一頁(yè)。 添加接頭：利用物理方法將待測(cè)樣品 DNA打碎，在單鏈DNA碎片兩端加上接頭。 第七十六頁(yè)，共九十一頁(yè)。 外表結(jié)合： Solexa的測(cè)序時(shí)利用微注射系統(tǒng)將已經(jīng)加過(guò)接頭和待測(cè)片段隨機(jī)添加到玻璃 Flow Cell內(nèi)，每一個(gè)Flow Cell又被分成 8條 Lane，每條 Lane的內(nèi)外表上能以共價(jià)鍵的形式隨機(jī)固定單鏈接頭序列和帶接頭的單鏈待測(cè)DNA片段。 第七十七頁(yè)，共九十一頁(yè)。 所有單鏈橋型待測(cè)片段擴(kuò)增成雙鏈橋片段，通過(guò)變性，釋放出互補(bǔ)的單鏈，錨定到附近的固相外表。通過(guò)不斷循環(huán)，將會(huì)在Flow Cell的固相外表上獲得上萬(wàn)條成簇分布的雙鏈待測(cè)片段。 第七十八頁(yè)，共九十一頁(yè)。 參加DNA聚合酶和被熒光標(biāo)記的dNTP和接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在每一個(gè)測(cè)序簇延伸互補(bǔ)鏈時(shí)，每參加一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相應(yīng)的熒光，測(cè)序儀通過(guò)捕獲熒光信號(hào)，并通過(guò)計(jì)算機(jī)將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序峰，從而獲得待測(cè)片段的序列信息。 第七十九頁(yè)，共九十一頁(yè)。 Solexa技術(shù)特點(diǎn)： 技術(shù)優(yōu)勢(shì)：測(cè)序性價(jià)比最高，運(yùn)行本錢低； 可擴(kuò)展的高通量； 需要樣品量少； 簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化 誤差來(lái)源：每次添加核苷酸之前對(duì)熒光信號(hào)的切割，如果切割不完全，產(chǎn)生誤差。 〔知道〕 第八十頁(yè)，共九十一頁(yè)。 、第三代測(cè)序技術(shù)： Heliscope單分子測(cè)序儀 原理：將基因組 DNA切割成隨機(jī)的小片段 DNA分子并且在每個(gè)片段末端加上polyA〔多聚腺嘌呤核糖核苷酸〕尾巴。通過(guò) polyA和固定在芯片上的 polyT雜交，將待測(cè)模板固定到芯片上，制成測(cè)序芯片。最后借助聚合酶將熒光標(biāo)記的單核苷酸摻入到引物上，采集熒光信號(hào)。之后切除熒光標(biāo)記基團(tuán)，進(jìn)行下一輪測(cè)序反響，如此反復(fù)，最終獲得完整的序列信息。 〔知道〕 第八十一頁(yè)，共九十一頁(yè)。 步驟： 隨即打碎待測(cè)片段， 3’末端加上 Poly〔 A〕 末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上 Cy3熒光標(biāo)記 用小片段與外表帶有寡聚 Poly〔 T〕的平板雜交 參加 DNA聚合酶和 Cy5熒光標(biāo)記的 dNTP〔對(duì)硫磷〕進(jìn)行 DNA合成反響，每一輪反響參加一種 dNTP。 洗脫未參與合成的 dNTP和 DNA聚合酶，檢測(cè)雜交位置的熒光信號(hào) 化學(xué)試劑去熒光標(biāo)記 重復(fù)合成、洗脫、成像、猝滅過(guò)程，完成測(cè)試。 〔知道〕 第八十二頁(yè)，共九十一頁(yè)。 Heli Scope的優(yōu)勢(shì)： 單分子測(cè)序減少了試劑的使用，測(cè)序本錢價(jià)格大大降低。 不需要擴(kuò)增建立 DNA庫(kù)，從而減少誤差。 第八十三頁(yè)，共九十一頁(yè)。 、第三代測(cè)序方法： SMRT法 原理： SMRT芯片是一種帶有很多 ZMW(zeromode waveguides)孔的厚度為100 nm的金屬片。將 DNA聚合酶、待測(cè)序列和不同熒光標(biāo)記的 dNTP放入ZMW孔的底部，進(jìn)行合成反響 。當(dāng)一個(gè) dNTP被添加到合成鏈上的同時(shí)，它會(huì)進(jìn)入 ZMW孔的熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類就可以判定 dNTP的種類。在下一個(gè) dNTP被添加到合成鏈之前，這個(gè)dNTP的磷酸基團(tuán)會(huì)被氟聚合物〔 fluoropolymer〕切割并釋放，熒光分子離開(kāi)熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)。 〔知道〕 第八十四頁(yè)，共九十一頁(yè)。 SMRT測(cè)序流程 第八十五頁(yè)，共九十一頁(yè)。 SMRT測(cè)序的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)： 特點(diǎn)：邊測(cè)序變合成，熒光標(biāo)記的位置是磷酸基團(tuán)而不是堿基。 優(yōu)勢(shì)： 速度很快，利用這種技術(shù)測(cè)序速度可以到達(dá)每秒 10個(gè) dNTP 。 信號(hào)強(qiáng)度大。由于 dNTP在熒光信號(hào)檢測(cè)區(qū)停留的時(shí)間〔毫秒級(jí)〕與它進(jìn)入和離開(kāi)的時(shí)間〔微秒級(jí)〕 相比會(huì)很長(zhǎng)，所以信號(hào)強(qiáng)度會(huì)很大。 第八十六頁(yè)，共九十一頁(yè)。 第三代測(cè)序方法：納米孔單分子法 Oxford NanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子技術(shù)是一種基于電信號(hào)測(cè)序的技術(shù)。他們?cè)O(shè)計(jì)了一種以 α溶血素為材料制作的納米孔，在孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭環(huán)糊精。用核酸外切酶切割 ssDNA〔單鏈 DNA〕時(shí)，被切下來(lái)的單個(gè)堿基會(huì)落入納米孔，并和納米孔內(nèi)的環(huán)糊精相互作用，短暫地影響流過(guò)納米孔的電流強(qiáng)度，這種電流強(qiáng)度的變化幅度就成為每種堿基的特征。堿基在納米孔內(nèi)的平均停留時(shí)間是毫秒級(jí)的，它的解離速率常數(shù)與電壓有關(guān)， 180 mV的電壓就能夠保證在電信號(hào)記錄后將堿基從納米孔中去除。而且納米孔單分子技術(shù)可直接讀取甲基化的胞嘧啶，而不像傳統(tǒng)方法那樣必須要用重亞硫酸鹽處理。該技術(shù)尚處于研發(fā)階段，目前面面臨的兩大問(wèn)題是尋找適宜的外切酶載體和承載納米孔平臺(tái)的材料。 〔了解〕 第八十七頁(yè)，共九十一頁(yè)。 納米孔單分子法示意圖 第八十八頁(yè)，共九十一頁(yè)。 納米孔單分子測(cè)序的特點(diǎn)： 準(zhǔn)確度高，納米孔單分子技術(shù)準(zhǔn)確率能到達(dá) %，且一旦發(fā)現(xiàn)替換錯(cuò)誤也能較容易地更改。〔因?yàn)?4種堿基中的 2種與另外 2種的電信號(hào)差異很明顯，因此只需在與檢測(cè)到的信號(hào)相符的 2種堿基中做出判斷，就可修正錯(cuò)誤?！? 另外由于每次只測(cè)定一個(gè)核苷酸因此該方法可以很容易地解決同聚物長(zhǎng)度的測(cè)量問(wèn)題。 不需要熒光標(biāo)記。 面臨問(wèn)題：尋找適宜的外切酶載體以及承載納米孔平臺(tái)的材料 第八十九頁(yè)，共九十一頁(yè)。 謝謝觀看 第九十頁(yè)，共九十一頁(yè)。 內(nèi)容總結(jié) 主要通過(guò)檢測(cè)什么檢測(cè)大腸桿菌：。?；撬崮軌蚴辜?xì)胞聚集從而改善檢測(cè)靈敏度 ,將少量的牛磺酸添加到懸浮液中。 2% RNase去除剖 (體積比 ):使用娃哈哈純潔水稀釋 RNase去除刻 ,用于芯片及 PCR耗材清潔。 末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上 Cy3熒光標(biāo)記。優(yōu)勢(shì)： 速度很快，利用這種技術(shù)測(cè)序速度可以到達(dá)每秒 10個(gè) dNTP。謝謝觀看 第九十一頁(yè)，共九十一頁(yè)。