【正文】 子伴侶，如：DnaK（70kDa），DnaJ（37kDa），GrpE（40kDa），GroEL（57kDa），和GroES（10kDa），再進(jìn)行一次純化可以改善。MBP 親和標(biāo)簽的純化原理：pMAL?系統(tǒng)是一種高效的蛋白融合表達(dá)及純化系統(tǒng)。pMAL載體含有編碼麥芽糖結(jié)合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP）的大腸桿菌malE基因，其下游的多克隆位點(diǎn)便于目的基因插入，表達(dá)N端帶有MBP的融合蛋白。通過“tac”強(qiáng)啟動(dòng)子和malE翻譯起始信號(hào)使克隆基因獲得高效表達(dá)，并進(jìn)一步利用MBP對(duì)麥芽糖的親和性達(dá)到用Amylose柱對(duì)融合蛋白的一步親和純化?！　?此系統(tǒng)的pMAL載體含有LacZα基因，目的基因的插入導(dǎo)致其失活，通過Xgal平板可進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。 pMAL載體都含有一段編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列，融合蛋白純化后，通過Factor Xa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTM I（G）可將目的蛋白與MBP切割分離。pMALTMc2 系列載體缺失malE 信號(hào)序列，導(dǎo)致融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。pMALp2系列載體含有malE 信號(hào)序列，它可引導(dǎo)融合蛋白穿過胞質(zhì)膜，進(jìn)入周質(zhì)。所有這些載體都含有一段編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列，融合蛋白純化后，通過Factor Xa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTM I（G）可將目的蛋白與MBP切割分離。Amylose 樹脂預(yù)裝柱是一親和基質(zhì)，用來分離與麥芽糖結(jié)合蛋白融合的目的蛋白。結(jié)合容量： mg MBPParamyosin 融合蛋白。貯存：本品預(yù)膨脹在20%的乙醇中，4176。C貯存。過柱緩沖液：20 mM TrisHCl， ，200 mM NaCl，1 mM EDTA。添加劑：1 mM sodiμm azide；10 mM β－mercaptoethanol 或1 mM DTT。洗脫緩沖液：過柱緩沖液+10 mM 麥芽糖實(shí)驗(yàn)步驟：（1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化，融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和細(xì)胞破碎同上。（2）融合蛋白的親和純化：預(yù)裝柱用8～12倍柱床體積的雙蒸水沖洗；預(yù)裝柱用9倍柱床體積過柱緩沖液平衡；將上述實(shí)驗(yàn)步驟三的上清液加入到柱床內(nèi)，～1 ml/min（建議每次上樣2～4ml）。用12倍柱床體積的過柱緩沖液淋洗未結(jié)合蛋白，每次用6ml，共4次。用4倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫與Amylose樹脂結(jié)合的MBP融合蛋白，～1 ml/min。收集3～5管樣品洗脫液，收集體積為1 ml/每管。通常，含目的蛋白的融合蛋白在一個(gè)柱床體積內(nèi)將被洗脫下來，可以通過波長(zhǎng)為280 nm的紫外吸收光或考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)。SDSPAGE檢測(cè)洗脫樣品*。再生。每次純化蛋白完畢后，需要及時(shí)對(duì)Amylose樹脂進(jìn)行再生。 Amylose樹脂可以采用下述清洗步驟進(jìn)行再生水3倍柱床體積% SDS3倍柱床體積水1倍柱床體積過柱緩沖液3倍柱床體積【注意事項(xiàng)】（1）每次使用時(shí)，請(qǐng)先打開頂端的帽子再移去底部的帽子，以避免氣泡進(jìn)入到預(yù)裝柱內(nèi)。（2）在使用本預(yù)裝柱時(shí)，請(qǐng)使用經(jīng)過脫氣后的緩沖液，以避免產(chǎn)生氣泡。（3）預(yù)裝柱在每次使用完畢后，在柱床上方加入2～4 ml 緩沖液或水，蓋上頂端的帽子后，隨即蓋上底部的帽子，豎立放置于4℃貯存。（4）％疊氮鈉的緩沖液中或20％乙醇中，以避免染菌?！緋MAL系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)】（1）75%的蛋白可獲得高效表達(dá)，蛋白產(chǎn)量可達(dá)100 mg/L （2）與其他幾種常用表達(dá)系統(tǒng)研究比較，與MBP融合表達(dá)更能提高E. coli表達(dá)蛋白的可溶性。（3）采用麥芽糖溫和洗脫：無去污劑或變性劑對(duì)蛋白活性的影響。（4）可在細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)中表達(dá)（pMALp2X載體）：周質(zhì)表達(dá)可提高二硫鍵的形成，促進(jìn)蛋白折疊的形成。蛋白的濃縮液是蛋白純化過程中常用的操作，常用的方法有：（1）透析袋濃縮法利用透析袋濃縮蛋白質(zhì)溶液是應(yīng)用最廣的一種。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋（無透析袋可用玻璃紙代替），結(jié)扎，把高分子（6 000～12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蠟）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可將吸水劑配成30～40％濃度的溶液，將裝有蛋白液的透析袋放入即可。吸水劑用過后，可放入溫箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。（2）冷凍干燥濃縮法這是濃縮蛋白質(zhì)的一種較好的辦法，它既使蛋白質(zhì)不易變性，又保持蛋白質(zhì)中固有的成分。它是在冰凍狀態(tài)下直接升華去除水分。具體做法是將蛋白液在低溫下冰凍，然后移置干燥器內(nèi)（干燥器內(nèi)裝有干燥劑，如NaOH、CaCl2和硅膠等）。密閉，迅速抽空，并維持在抽空狀態(tài)。數(shù)小時(shí)后即可獲得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白質(zhì)保存方便，應(yīng)用時(shí)可配成任意濃度使用。也可采用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。（3）超濾膜濃縮法此法是利用微孔纖維素膜通過高壓將水分濾出，而蛋白質(zhì)存留于膜上達(dá)到濃縮目的。有兩種方法進(jìn)行濃縮：一種是用醋酸纖維素膜裝入高壓過濾器內(nèi)，在不斷攪拌之下過濾。另一種是將蛋白液裝入透析袋內(nèi)置于真空干燥器的通風(fēng)口上，負(fù)壓抽氣，而使袋內(nèi)液體滲出。（4）凝膠濃縮法選用孔徑較小的凝膠，如SephadexG25或G50，將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據(jù)干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數(shù)而稱取所需的干膠量。放入冰箱內(nèi)，凝膠粒子吸水后，通過離心除去。定量作為生物實(shí)驗(yàn)室的日常工作之一，具有非常重要的意義。在生物學(xué)相關(guān)的研究中，無論是對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)譜的定量比較還是蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析，都建立在準(zhǔn)確的定量這一基礎(chǔ)之上。蛋白質(zhì)的快速定量方法主要依靠蛋白質(zhì)本身的發(fā)色基團(tuán)，或其與其它顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的紫外吸收來進(jìn)行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三種。（1）直接紫外吸收法由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，所以任何一個(gè)蛋白質(zhì)都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關(guān)系，我們可以對(duì)其進(jìn)行定量。紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量迅速、簡(jiǎn)便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。因此，已在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進(jìn)行紫外檢測(cè)，來判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況。但該法存在無法彌補(bǔ)的缺陷。首先，對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差，故該法適于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。其次，若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大干擾。例如，在制備酶的過程中，層析柱的流出液中有時(shí)混雜有核酸，應(yīng)予以校正。（2）Bradford法目前，實(shí)驗(yàn)室一般不采用紫外吸收法，而通常采用改良的Bradford法進(jìn)行測(cè)定蛋白質(zhì)含量。其原理為，蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合，使得染料最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm，在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比，測(cè)定595nm處吸光度的增加即可進(jìn)行蛋白定量。測(cè)定時(shí)一般用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。該法測(cè)定要求樣品中不能有能與考馬斯亮藍(lán)G250反應(yīng)顯色的去污劑，比如Triton、NP400、吐溫等。與具體操作可參考相關(guān)試劑盒說明書。（3）Lorry法其原理是蛋白質(zhì)與堿性銅溶液中的Cu2+絡(luò)和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與福林試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色，在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各種蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測(cè)定時(shí)需使用同種蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)。具體操作可參考相關(guān)試劑盒說明書。一般而言，紫外吸收法適合于與色譜柱聯(lián)用，達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控，然而較不準(zhǔn)確。Bradford法適合于大規(guī)模測(cè)定樣品，但是樣品中不能含有太高濃度的去污劑，對(duì)樣品的要求較高。改良的Lorry法不再排斥去污劑，相對(duì)的操作就比較復(fù)雜。我們需要在試驗(yàn)中按照要求選用不同的定量方法。目前后兩種常用的定量方法都有相關(guān)的試劑盒采用。純化的蛋白往往需要在一定的保存條件，以保證目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定，避免活性喪失。蛋白溶液的保存原則：（1）緩沖液pH 避免接近蛋白的等電點(diǎn)；（2）根據(jù)每次使用的量分裝成多管，這樣可避免反復(fù)凍融；（3）加入穩(wěn)定劑如甘油，DTT, TritonX100等。具體操作根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和蛋白特性，多數(shù)蛋白都可以加入終濃度為50%的甘油后－80℃保存。