【正文】 子伴侶，如：DnaK（70kDa），DnaJ（37kDa），GrpE（40kDa），GroEL（57kDa），和GroES（10kDa），再進行一次純化可以改善。MBP 親和標簽的純化原理：pMAL?系統(tǒng)是一種高效的蛋白融合表達及純化系統(tǒng)。pMAL載體含有編碼麥芽糖結(jié)合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP）的大腸桿菌malE基因，其下游的多克隆位點便于目的基因插入，表達N端帶有MBP的融合蛋白。通過“tac”強啟動子和malE翻譯起始信號使克隆基因獲得高效表達，并進一步利用MBP對麥芽糖的親和性達到用Amylose柱對融合蛋白的一步親和純化?！　?此系統(tǒng)的pMAL載體含有LacZα基因，目的基因的插入導(dǎo)致其失活，通過Xgal平板可進行藍白斑篩選。 pMAL載體都含有一段編碼蛋白酶識別位點的序列，融合蛋白純化后，通過Factor Xa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTM I（G）可將目的蛋白與MBP切割分離。pMALTMc2 系列載體缺失malE 信號序列，導(dǎo)致融合蛋白在細胞質(zhì)中表達。pMALp2系列載體含有malE 信號序列，它可引導(dǎo)融合蛋白穿過胞質(zhì)膜，進入周質(zhì)。所有這些載體都含有一段編碼蛋白酶識別位點的序列，融合蛋白純化后，通過Factor Xa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTM I（G）可將目的蛋白與MBP切割分離。Amylose 樹脂預(yù)裝柱是一親和基質(zhì)，用來分離與麥芽糖結(jié)合蛋白融合的目的蛋白。結(jié)合容量： mg MBPParamyosin 融合蛋白。貯存：本品預(yù)膨脹在20%的乙醇中，4176。C貯存。過柱緩沖液：20 mM TrisHCl， ，200 mM NaCl，1 mM EDTA。添加劑：1 mM sodiμm azide；10 mM β－mercaptoethanol 或1 mM DTT。洗脫緩沖液：過柱緩沖液+10 mM 麥芽糖實驗步驟：（1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化，融合蛋白的誘導(dǎo)表達和細胞破碎同上。（2）融合蛋白的親和純化：預(yù)裝柱用8～12倍柱床體積的雙蒸水沖洗；預(yù)裝柱用9倍柱床體積過柱緩沖液平衡；將上述實驗步驟三的上清液加入到柱床內(nèi)，～1 ml/min（建議每次上樣2～4ml）。用12倍柱床體積的過柱緩沖液淋洗未結(jié)合蛋白，每次用6ml，共4次。用4倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫與Amylose樹脂結(jié)合的MBP融合蛋白，～1 ml/min。收集3～5管樣品洗脫液，收集體積為1 ml/每管。通常，含目的蛋白的融合蛋白在一個柱床體積內(nèi)將被洗脫下來，可以通過波長為280 nm的紫外吸收光或考馬斯亮藍蛋白檢測法進行檢測。SDSPAGE檢測洗脫樣品*。再生。每次純化蛋白完畢后，需要及時對Amylose樹脂進行再生。 Amylose樹脂可以采用下述清洗步驟進行再生水3倍柱床體積% SDS3倍柱床體積水1倍柱床體積過柱緩沖液3倍柱床體積【注意事項】（1）每次使用時，請先打開頂端的帽子再移去底部的帽子，以避免氣泡進入到預(yù)裝柱內(nèi)。（2）在使用本預(yù)裝柱時，請使用經(jīng)過脫氣后的緩沖液，以避免產(chǎn)生氣泡。（3）預(yù)裝柱在每次使用完畢后，在柱床上方加入2～4 ml 緩沖液或水，蓋上頂端的帽子后，隨即蓋上底部的帽子，豎立放置于4℃貯存。（4）％疊氮鈉的緩沖液中或20％乙醇中，以避免染菌?！緋MAL系統(tǒng)的優(yōu)勢】（1）75%的蛋白可獲得高效表達，蛋白產(chǎn)量可達100 mg/L （2）與其他幾種常用表達系統(tǒng)研究比較，與MBP融合表達更能提高E. coli表達蛋白的可溶性。（3）采用麥芽糖溫和洗脫：無去污劑或變性劑對蛋白活性的影響。（4）可在細胞質(zhì)或周質(zhì)中表達（pMALp2X載體）：周質(zhì)表達可提高二硫鍵的形成，促進蛋白折疊的形成。蛋白的濃縮液是蛋白純化過程中常用的操作，常用的方法有：（1）透析袋濃縮法利用透析袋濃縮蛋白質(zhì)溶液是應(yīng)用最廣的一種。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋（無透析袋可用玻璃紙代替），結(jié)扎，把高分子（6 000～12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蠟）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可將吸水劑配成30～40％濃度的溶液，將裝有蛋白液的透析袋放入即可。吸水劑用過后，可放入溫箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。（2）冷凍干燥濃縮法這是濃縮蛋白質(zhì)的一種較好的辦法，它既使蛋白質(zhì)不易變性，又保持蛋白質(zhì)中固有的成分。它是在冰凍狀態(tài)下直接升華去除水分。具體做法是將蛋白液在低溫下冰凍，然后移置干燥器內(nèi)（干燥器內(nèi)裝有干燥劑，如NaOH、CaCl2和硅膠等）。密閉，迅速抽空，并維持在抽空狀態(tài)。數(shù)小時后即可獲得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白質(zhì)保存方便，應(yīng)用時可配成任意濃度使用。也可采用凍干機進行冷凍干燥。（3）超濾膜濃縮法此法是利用微孔纖維素膜通過高壓將水分濾出，而蛋白質(zhì)存留于膜上達到濃縮目的。有兩種方法進行濃縮：一種是用醋酸纖維素膜裝入高壓過濾器內(nèi)，在不斷攪拌之下過濾。另一種是將蛋白液裝入透析袋內(nèi)置于真空干燥器的通風(fēng)口上，負壓抽氣，而使袋內(nèi)液體滲出。（4）凝膠濃縮法選用孔徑較小的凝膠，如SephadexG25或G50，將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據(jù)干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數(shù)而稱取所需的干膠量。放入冰箱內(nèi)，凝膠粒子吸水后，通過離心除去。定量作為生物實驗室的日常工作之一，具有非常重要的意義。在生物學(xué)相關(guān)的研究中，無論是對蛋白質(zhì)表達譜的定量比較還是蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析，都建立在準確的定量這一基礎(chǔ)之上。蛋白質(zhì)的快速定量方法主要依靠蛋白質(zhì)本身的發(fā)色基團，或其與其它顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的紫外吸收來進行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三種。（1）直接紫外吸收法由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，所以任何一個蛋白質(zhì)都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關(guān)系，我們可以對其進行定量。紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，已在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進行紫外檢測，來判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況。但該法存在無法彌補的缺陷。首先，對于測定那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差，故該法適于測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。其次，若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大干擾。例如，在制備酶的過程中，層析柱的流出液中有時混雜有核酸，應(yīng)予以校正。（2）Bradford法目前，實驗室一般不采用紫外吸收法，而通常采用改良的Bradford法進行測定蛋白質(zhì)含量。其原理為，蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍G250結(jié)合，使得染料最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm，在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比，測定595nm處吸光度的增加即可進行蛋白定量。測定時一般用牛血清白蛋白作為標準品。該法測定要求樣品中不能有能與考馬斯亮藍G250反應(yīng)顯色的去污劑，比如Triton、NP400、吐溫等。與具體操作可參考相關(guān)試劑盒說明書。（3）Lorry法其原理是蛋白質(zhì)與堿性銅溶液中的Cu2+絡(luò)和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與福林試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍色，在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各種蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測定時需使用同種蛋白質(zhì)作標準。具體操作可參考相關(guān)試劑盒說明書。一般而言，紫外吸收法適合于與色譜柱聯(lián)用，達到實時監(jiān)控，然而較不準確。Bradford法適合于大規(guī)模測定樣品，但是樣品中不能含有太高濃度的去污劑，對樣品的要求較高。改良的Lorry法不再排斥去污劑，相對的操作就比較復(fù)雜。我們需要在試驗中按照要求選用不同的定量方法。目前后兩種常用的定量方法都有相關(guān)的試劑盒采用。純化的蛋白往往需要在一定的保存條件，以保證目標蛋白的穩(wěn)定，避免活性喪失。蛋白溶液的保存原則：（1）緩沖液pH 避免接近蛋白的等電點；（2）根據(jù)每次使用的量分裝成多管，這樣可避免反復(fù)凍融；（3）加入穩(wěn)定劑如甘油，DTT, TritonX100等。具體操作根據(jù)實驗需要和蛋白特性，多數(shù)蛋白都可以加入終濃度為50%的甘油后－80℃保存。