【正文】 純化的蛋白往往需要在一定的保存條件，以保證目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定，避免活性喪失。與具體操作可參考相關(guān)試劑盒說明書。但該法存在無法彌補的缺陷。放入冰箱內(nèi)，凝膠粒子吸水后，通過離心除去。數(shù)小時后即可獲得含有蛋白的干燥粉末。蛋白的濃縮液是蛋白純化過程中常用的操作，常用的方法有：（1）透析袋濃縮法利用透析袋濃縮蛋白質(zhì)溶液是應(yīng)用最廣的一種。每次純化蛋白完畢后，需要及時對Amylose樹脂進行再生。洗脫緩沖液：過柱緩沖液+10 mM 麥芽糖實驗步驟：（1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化，融合蛋白的誘導(dǎo)表達和細胞破碎同上。pMALp2系列載體含有malE 信號序列，它可引導(dǎo)融合蛋白穿過胞質(zhì)膜，進入周質(zhì)。過度超聲還會增加宿主內(nèi)源蛋白與GST融合目的蛋白共純化共價共純化：膠上有些多出來的條帶是共純化的促進蛋白正確折疊的分子伴侶，如：DnaK（70kDa），DnaJ（37kDa），GrpE（40kDa），GroEL（57kDa），和GroES（10kDa），再進行一次純化可以改善。洗脫緩沖液不新鮮： 10XGST洗脫緩沖液－20℃下可以穩(wěn)定存放6個月，最多耐受5次凍融。任何上述處理后應(yīng)該立即用10倍柱體積1X GST Bind/Wash buffer平衡。方法一：是不切除GSTtag，可以向（6）中的樹脂中加入1～2ml 的洗脫緩沖液（50 mM TrisHCl，10 mM 還原性谷胱甘肽（GSH），pH ），輕輕混勻然后4℃溫育10min，收集流出液，即為GSTGFP的純化產(chǎn)物。 GST 親和標(biāo)簽純化的使用（1）從4℃冷柜中取出Glμtathione Sepharose 4B（本產(chǎn)品購置GE公司，儲存于20%乙醇，樹脂的量和20%乙醇1：1），輕柔、充分翻轉(zhuǎn)搖勻樹脂懸濁液。 GST 親和標(biāo)簽的純化谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶（GST）是繼組氨酸之后的第二個應(yīng)用最多的重組蛋白標(biāo)記。（8）用1倍體積的75%乙醇洗。用戶需要自行準(zhǔn)備25%，50%，75%，100%（v/v）乙醇和去離子水。分步或者線性洗脫摸索出最優(yōu)的咪唑結(jié)合和清洗濃度；在樣品中加入與結(jié)合緩沖液同樣濃度的咪唑；咪唑的梯度不大（20個或更多的柱床體積），可能分離出有相似結(jié)合強度的蛋白。策略：減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。策略：在變性條件下(用4～8 M 脲，或4～6 M鹽酸胍)進行純化。（5）具體方法和過程與上面步驟一致。（2）用考馬斯亮藍或銀染液進行染色，檢測重組蛋白的純化程度，并找到咪唑最合適洗脫濃度，也就是純化蛋白含量最多的一管洗脫液所對應(yīng)的濃度；并將該純化出來的蛋白質(zhì)經(jīng)過PD10柱子以去掉溶液中的咪唑。（3）用10倍ml的starting buffer進行漂洗，收集濾過液。（7）12000 rpm，離心2min，收集菌體。最后用更高咪唑濃度的緩沖液（洗脫緩沖液）將目標(biāo)蛋白洗脫下來，此時目標(biāo)蛋白特異性的存在于該咪唑濃度的洗脫液中，從而得到純化了的目標(biāo)蛋白質(zhì)。（14）儀器使用過程中出現(xiàn)故障應(yīng)及時與負責(zé)人聯(lián)系。（5）嚴禁將出樣閥過分擰緊，否則會損壞內(nèi)部撞針，以不流出液體為準(zhǔn)。（8）松開固定夾，取出高壓腔，重新倒置于三腳固定器上，取出底座。（6）雙手托起整個高壓腔組件，翻轉(zhuǎn)至正向位置，將其置于升降臺上（事先要確保操作臺足夠的低，以容的下整個組件），向后推動底座，使底座固定于三個位置校準(zhǔn)針之間，并調(diào)整腔體使針形閥朝向正面。（2）將三腳固定器置于水平桌面上，將高壓腔正放在固定器器上；在活塞桿的O型環(huán)、底座的O型環(huán)和針形閥的O型環(huán)上均勻涂上少量凡士林。（2）如果超聲時出現(xiàn)黑色沉淀，說明超聲功率太強。（2）加入預(yù)冷的緩沖液50ml，重懸細胞洗滌菌體一次，12000 rpm，4℃離心2min，收集菌體；常規(guī)的操作所使用的緩沖液多為PBS 或者 TrisNaCl，針對不同的載體和純化方法，選擇相應(yīng)的緩沖液。表2. 配制SDSPAGE 不同濃度分離膠的配置不同體積（ml）凝膠液中各成分所需體積（ml）Gel%組成所需要各成份體積（ml）510152025306%水30%丙烯酰胺溶液123456()510%SDS10%過硫酸氨TEMED8%水30%丙烯酰胺溶液48()510%SDS10%過硫酸氨TEMED10%水430%丙烯酰胺溶液510()510%SDS10%過硫酸氨TEMED12%水30%丙烯酰胺溶液24681012()510%SDS10%過硫酸氨TEMED15%水30%丙烯酰胺溶液51015()510%SDS10%過硫酸氨TEMED樣品的制備在蛋白溶液中加入等體積的2樣品溶解液，混合液在沸水浴中加熱5min，冷卻后即可上樣。凝膠制備（1）安裝洗滌干凈的玻璃板、板條，并將玻璃板固定在電泳槽中。（3）10% SDS溶液：SDS 加入ddH2O ToTo100。本小節(jié)列出SDSPAGE 操作中一些試劑的配置及其基本的操作過程。若在上清中有明顯的目的蛋白的條帶，即可以放大培養(yǎng)進而純化目標(biāo)蛋白。與實現(xiàn)外源蛋白的穩(wěn)定表達相比，更多時候保證目標(biāo)蛋白的可溶性表達，是建立表達條件的主要工作。RP，BL21 CodonPlus174。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosettagami （DE3）菌株帶有 trxB和gor雙突變。作為表達宿主菌必須具備幾個基本特點：遺傳穩(wěn)定，生長速度快，表達蛋白穩(wěn)定。His 標(biāo)簽具有較小的分子量，融合于目標(biāo)蛋白的N端和C端不影響目標(biāo)蛋白的活性，因此純化過程中大多不需要去除。因此熟練掌握并運用大腸桿菌表達系統(tǒng)的基本原理和常規(guī)操作是對每一個研究生來說是非常必要的。常用的用于親和純化融合標(biāo)簽包括 PolyArg，PolyHis, StrepTag Ⅱ，Stag，MBP等。當(dāng)然，GST 具有較大的分子量（26kDa），可能對目的蛋白的活性有影響，因此很多時候切除GST是必須的。BL21（DE3）： DE3噬菌體溶源于BL21 形成的帶有染色體T7 RNA 聚合酶基因大腸桿菌。 （DE3）RIPL，BL21CodonPlμs174。另一個需要考慮的是大腸桿菌的密碼子及其偏愛性。再加入300～500ml PBS重懸細胞。對于一些蛋白可能無法實現(xiàn)可溶性表達，這時候溶解包涵體后再純化是唯一的解決辦法。可認為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹慎操作，因為它還可能會含有少量未聚合材料。（8）5Tris甘氨酸電極緩沖液： Tris，94g甘氨酸和5g SDS定容到1000ml（建議每次電泳用新稀釋的緩沖液）。（5）灌注積層膠，立即插入干凈的梳子，避免產(chǎn)生氣泡。Tip：染色前可將染色液在微波爐里加熱至沸，然后搖床震蕩染色約10min即可?！?誘導(dǎo)后的菌液收集菌體，然后視菌體的量加入300～500μl的緩沖液重懸細胞，然后置于冰上超聲破碎。（6）SDSPAGE 分析蛋白表達情況。高壓破碎是大量的破碎提取細胞內(nèi)成份的首先方法，相對于超聲破碎，它具有過程溫和，操作迅速等優(yōu)點，具體使用需要根據(jù)具體的儀器使用說明。視樣品體積，大致估計并調(diào)整活塞桿的位置。（7）取一冰預(yù)冷的離心管（或者將離心管至于冰中）置于樣品噴射管出口處，輕輕逆時針轉(zhuǎn)動針形閥，小心控制樣品的流出速度，根據(jù)破碎程度決定流速（建議在噴射管出口處接一個1cm長的透明的塑料管如