真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌的表達(dá)載體克隆的真核(參考版)
2025-07-23 04:11本頁面
【正文】 。 不同生物密碼子的偏愛性，是阻礙外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的一種重要因素。 b. mRNA的穩(wěn)定性對表達(dá)效率的影響 a. 密碼子使用的偏愛性現(xiàn)象的規(guī)律性 ?幾乎在所有的簡并密碼子家族中，都有一個或兩個是優(yōu)先使用的偏愛性密碼子； ? 一些密碼子在各種不同基因中都是最常用的（在編碼脯氨酸 4種同義密碼子， CCC是優(yōu)先使用的） ? 高表達(dá)活性的基因比低表達(dá)活性的基因，呈現(xiàn)出較高程度的密碼子偏愛性 ? 簡并密碼子的使用頻率，反應(yīng)它們相應(yīng)的 tRNA豐度。 b. 啟動子與克隆基因的間隔距離對表達(dá)效率的影響 當(dāng) mRNA分子 5’－末端與 SD序列之間的長度小于 15bp時，轉(zhuǎn)譯效率下降。 3. Xa切割法： 能唯一地從特異識別序列 C－末端切割多肽 影響克隆基因在大腸桿菌中的 表達(dá)效率因素 1. 5’UTR對克隆基因表達(dá)效率的影響 a. 啟動子結(jié)構(gòu)對表達(dá)效率的影響 大腸桿菌啟動子的保守序－ 35區(qū)（ 5’TTGACA）和－ 10(5’TATAAT)區(qū) 。 ： 能特異性的從甲硫氨酸殘基處切割多肽鏈。 融合蛋白質(zhì)的純化 基本原理： 利用與融合蛋白質(zhì) 配偶體 相對應(yīng)的配體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白質(zhì)被滯留下來，其它蛋白質(zhì)則流出駐外，經(jīng)洗脫處理，便可回收到純化的融合蛋白質(zhì)。 由 DNA體外重組構(gòu)成的融合基因有兩種類型 一、由報告基因的編碼序列區(qū)和另一個 基因的啟動子及其調(diào)節(jié)序列構(gòu)成的 二、由一種異源蛋白質(zhì)基因的編碼序列 區(qū)同寄主細(xì)胞的誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)成 融合蛋白質(zhì)：由克隆在一起的兩個或數(shù)個不同基因的編碼序列組成的融合基因，轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的單一的多肽序列。（不是特別有效的程序） 2. 誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。 優(yōu)點： 1. 由于周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類比較少，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化就比較簡單 2. 蛋白質(zhì)酶解的程度不甚嚴(yán)重 3. 促進(jìn)了二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊作用（氧化環(huán)境） 4. 蛋白質(zhì)的 N－末端結(jié)構(gòu)真實 在正確折疊的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)運過程中，在體內(nèi)對信號肽進(jìn)行切割 缺點： 1. 信號肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運 2. 有可能形成包涵體 胞外表達(dá)： 使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞外培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化。使蛋白質(zhì)的真實性受影響 4. 蛋白質(zhì)會被酶解 ，因此純化比較復(fù)雜 周質(zhì)中表達(dá)： 周質(zhì)：在大腸桿菌一類格蘭氏陰性菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。 3. 表達(dá)的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡單。 包涵體：存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。而且這種質(zhì)粒是溫度敏感型的載體。 若由 pKN402質(zhì)粒的 DNA復(fù)制起點取代pPLc2833質(zhì)粒的 DNA復(fù)制起點，由此形成的新質(zhì)粒 pCP3。 pPLc2833表達(dá)載體 調(diào)節(jié)型強啟動子：能夠使克隆的真核基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞中最有效的高水平表達(dá)。 這種啟動子可接受熱敏感的 λ 阻遏蛋白質(zhì)的抑制。 EcoR?單切點靠近 λ PL啟動子，處于轉(zhuǎn)譯起始密碼子之前。 這個質(zhì)粒表達(dá)載體含有 MS2聚合酶基因開始的 98個密碼子，不具有轉(zhuǎn)譯起始密碼子的外源片斷也能實現(xiàn)表達(dá)。 42度時，阻遏蛋白失活； 2830度時， PL啟動子完全被阻遏蛋白抑制。 ? Trp啟動子表達(dá)載體已用來生產(chǎn)了 α 干擾素和 γ 干擾素 ? 三啟動子串聯(lián)單元表達(dá)效率高于單啟動子單元 PL啟動子的表達(dá)載體 是一
語文相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1