【正文】 如何通過(guò)基因工程技術(shù)改道真核生物的糖基化多酶體系使其能整合到 大腸桿菌的染色體中和對(duì)耱基化位置、糖基種類和長(zhǎng)度進(jìn)行控制等。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 重組蛋白質(zhì)修飾加工研究 蛋白質(zhì) C末端酰胺化 和 側(cè)鏈糖基化 是常見(jiàn)的翻譯后修飾加工類型 目前 C末端酰胺化一般都是在體外通過(guò) 肽酰甘氨酸酰胺酶 把 C末端甘氨酸轉(zhuǎn)換為胺基 把其他微生物的肽酰甘氨酸酰胺化酶，真核生物糖基化過(guò)程所涉及的酶系導(dǎo)入大腸桿菌的設(shè)想很早就被提出，但這些工作都還在探索之中。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 大腸桿菌表面表達(dá)技術(shù)的建立 主要通過(guò)三條途徑使目標(biāo)蛋白呈現(xiàn)在菌體表面 : 把外源序列插入 LamB 、 OmpA、 PhoE 等外膜蛋白的膜外區(qū) 把外源蛋白導(dǎo)入大腸桿菌鞭毛或傘毛的結(jié)構(gòu)中 這二種方法適合表達(dá)一段長(zhǎng)度小于 100 個(gè)氨基酸殘基的外源序列， 因?yàn)檩^大的外源序列的插入往往會(huì)使外膜蛋白不能形成原來(lái)的三維 結(jié)構(gòu)，影響它轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和在膜上的定位。 外源蛋白質(zhì)在菌體表面表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)是大腸桿菌可直接用于制備疫苗 ， 進(jìn)行生物催化和作為探針篩選藥物 。 這一結(jié)果為天然信號(hào)肽優(yōu)化 改造的設(shè)計(jì)提供了很好的參考依據(jù) 。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 改造信號(hào)肽的序列和結(jié)構(gòu)，提高分泌效率 改造 信號(hào)肽 的序列和結(jié)構(gòu) ， 提高分泌效率 比較成功的例子是發(fā)現(xiàn)了把堿性磷酸酯酶基因 phoA 信號(hào)肽的疏水區(qū) 置換為多聚 Leu 殘基能明顯提高分泌效率 。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 降低蛋白質(zhì)合成的速率 ， 從而增加正確折疊重組蛋白質(zhì) 從 phoA 基因 合成速率低的突變株 中發(fā)現(xiàn)其分泌在周質(zhì)空間的 phoA 基 因的產(chǎn)物 堿性磷酸酯酶比野生型菌株有 顯著增加 ， 由于只有構(gòu)象正 確的酶原才能被大腸桿菌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)識(shí)別和分泌 ， 這一結(jié)果表明了目 標(biāo)蛋白合成的速率能對(duì)其構(gòu)象形成正確與否產(chǎn)生影響 。 PDl 對(duì)目標(biāo)蛋白的二硫鍵形成和正確折疊的促進(jìn)作用可以受到谷 胱甘肽的調(diào)節(jié)。 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 共表達(dá)人或小鼠的二硫鍵異構(gòu)酶、促進(jìn)二硫鍵形成和正確折疊 大腸桿菌周質(zhì)空間通過(guò) 二硫鍵形成酶 DsbA 和 DsbB 二個(gè)蛋白維持適 當(dāng)?shù)难趸€原態(tài)勢(shì)使蛋白質(zhì)的二硫鍵形成。 研究表明這種作用是具有 專一性 的 ， 不同的目標(biāo)蛋白需要不同類型的蛋白因子共表達(dá) 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 五、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì) 構(gòu)建各種表達(dá)載體 建立新的表達(dá)系統(tǒng) 目前研究的重點(diǎn)完善現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)，解決表達(dá)系統(tǒng)中還存在的缺陷 等方面。 rpoH 基因缺陷的突變株己經(jīng)被構(gòu)建 ， 研究結(jié)果表明它能明顯提高目標(biāo)基因的表達(dá)水平 。 為了使對(duì)蛋白水解酶比較敏感的目標(biāo)蛋白也能獲得較高水平的表達(dá) ， 需要 構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 。 改變代謝流的方向 ， 通過(guò)共轉(zhuǎn)化把枯草桿菌 、 釀酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS， 單胞菌的丙酮酸脫羧酶基因 pdc1 和乙醇脫氫酶基因 adh2 導(dǎo)入大腸桿菌 ， 使丙酮酸的代謝有選擇地向生成 3‘羥基丁酮或乙醇的方向進(jìn)行 。 從而降低菌體產(chǎn)生乙酸所要求的溶氧飽和度閥值 。 因此 構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌 ， 是從恨本上解決問(wèn)題的途徑之一 。 雖然在發(fā)酵過(guò)程中可 采取通氧氣 ， 提高攪拌速度 ， 控制補(bǔ)料速度 等措施來(lái)控制溶氧飽和度 ， 減少乙酸的產(chǎn)生 。 目前常用的發(fā)酵方式有：恒定培養(yǎng)、流加補(bǔ)料培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)三種 構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌 高密度發(fā)酵后期由于菌體的生長(zhǎng)密度較高 ， 培養(yǎng)基中的溶氧飽和度往往比較低 ， 氧氣的不足導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)速率降低和乙酸的累積 ， 乙酸的存在對(duì)目標(biāo)基因的高效表達(dá)有明顯的阻抑作用 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞 大腸桿菌高密度發(fā)酵是大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)過(guò)程中不可缺少的工藝步驟。 化學(xué)法比酶法成本低 ，但不少裂解試劑有毒性 。 融合蛋白和串聯(lián)聚合蛋白需要用酶或化學(xué)的方法切割出單體目標(biāo)蛋白 。 蛋白水解酶含量低的菌株往往代謝不旺盛 ， 生長(zhǎng)速率慢 ， 使高密度發(fā)酵比較困難 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 但必須指出的是 ， 由于目標(biāo)蛋白本身的性質(zhì)和用途的不同 ， 上述幾種方法在使用上是受到一定的限制的 。 對(duì)蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行改造 。 對(duì)分子量較小的目標(biāo)基因進(jìn)行融合表達(dá)或串聯(lián)聚合表達(dá) 。 在細(xì)胞內(nèi)有多肽碎片 、 突變的異常蛋白和外界物理因素的刺激的條件 下 ， 大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的蛋白水解酶活力往往能達(dá)到比較高的水平 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 蛋白水解酶的特點(diǎn) 細(xì)胞質(zhì)是蛋白水解酶含量最多的區(qū)域 ， 目標(biāo)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中最容易受 到蛋白水解酶的作用 。 所有的結(jié)論要通過(guò)實(shí)驗(yàn)才能得出 。 現(xiàn)在還沒(méi)有一個(gè)固定規(guī)則來(lái)判定稀有密碼子的存在是否確實(shí)會(huì)對(duì)翻譯過(guò)程產(chǎn)生明顯的不利影響 。 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)稀有密碼子 tRNA 基因 ， 以提高大腸桿菌細(xì)胞 內(nèi)稀有密碼子 tRNA 的豐度 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 在所有的大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 中 ， tRNA Arg (AGG/AGA) 含量最少 ， 而 AGG 和 AGA 密碼子在真核基因中經(jīng)常出現(xiàn) 。 編碼 Gly 的密碼子 GGA、 GGG 編碼 Leu 的密碼子 CUA、 CUC 編碼 Ile 的密碼子 AUA 編碼 Ser 的密碼子 UCA、 AUG、 UCG、 UCC 編碼 Thr 的密碼子 ACA 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 由于同義密碼子的使用頻率與細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)的 tRNA 的豐度有正比關(guān)系稀有密碼子對(duì)應(yīng)的 tRNA 的豐度很低 ， 有可能在翻譯過(guò)程中發(fā)生中止和移碼突變 。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 表達(dá)水平高的基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛(ài)性高于表達(dá)水平低的基因 。 把目標(biāo)基因設(shè)計(jì)成多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu) ， 在大腸桿菌本身的高效翻譯起始元件后加上第二個(gè) SD 序列和目標(biāo)基因 ， 一起插入表達(dá)載體 。 盡量提高核糖體結(jié)合位點(diǎn)本身和附近的序列中 A/T 堿基的含量 ， 降低 mRNA 5’ 端形成的 “ 莖環(huán) ” 結(jié)構(gòu)的可能性 ， 也是構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒時(shí)需要注意的事項(xiàng) 。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的變化對(duì) mRNA 的翻譯效率有顯著影響，具體表現(xiàn)為： SD 序列 UAAGGAGG 的翻譯效率要比 AAGGA 高 3～ 6倍 翻譯起始密碼 ATG 與 UAAGGAGG的最適距離是 6～ 8 個(gè)堿基長(zhǎng)度， 與 AAGAA 的最適距離是 5～ 7 個(gè)堿基長(zhǎng)度 ATG 與 UAAGGAGG 至少相隔 3 ～ 4個(gè)堿基，與 AAGAA 至少相隔 5 個(gè)堿基； mRNA 的翻譯才能進(jìn)行 ATG 與 SD 序列之間的堿基組成為 A， T 堿基豐富時(shí)， mRNA 翻譯效 率較高。 由于每一個(gè)基因都具有各自獨(dú)特的 5’ 端結(jié)構(gòu)，最終構(gòu)建成的各種表達(dá)質(zhì)粒所具有的核糖體結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)變量。 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì) 共表達(dá)大腸桿菌稀有密碼子 tRNA 基因 提高目標(biāo)基因 mRNA 和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性 高密度發(fā)酵和工程化宿主細(xì)胞 四、高效表達(dá)目標(biāo)基因的戰(zhàn)略和技術(shù) 表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化和設(shè)計(jì) 在各種表達(dá)載體中，啟動(dòng)子和 SD序列的下游都設(shè)計(jì)了一段含有各種限制性酶切位點(diǎn)的序列，用于目標(biāo)基因的插入。 目標(biāo)蛋白外泌表達(dá) 把所表達(dá)的目標(biāo)蛋白外泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中可以進(jìn)一步減少蛋白水解酶的降解 ， 也有利于分離純化 。 ⑵ 目標(biāo)蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間過(guò)程中 信號(hào)肽 被加工切除，有效地避免了 N 端附加的甲硫氨酸的產(chǎn)生。 目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá) 目標(biāo)蛋白在周質(zhì)空間中表達(dá)的優(yōu)點(diǎn) ⑴ 大腸桿菌周質(zhì)空間中自身蛋白質(zhì)的數(shù)量約為 100 種，只占菌體總蛋白數(shù)量的 4%。 目標(biāo)蛋白與有親合配基的序列融合表達(dá)既可以提高分離純化的效率，又能在融合蛋白切離的過(guò)程中得到?jīng)]有附加甲硫氨酸目標(biāo)蛋白。 但它們都對(duì) 與甲硫氨酸相鄰的氨萊酸殘基 類型有一定要求 ， 因此在使用上有一定的限制 。 去除附加的甲硫氨酸有二種方法 ： ⑴ 在表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)甲硫氨酸氨肽酶基因 。 ⑵ 另外 ， 附加的甲硫氨酸也可能 改變蛋白質(zhì)的免疫性質(zhì)和藥理性質(zhì) 。 分泌型異源蛋白的表達(dá) 在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì) 在細(xì)胞質(zhì)中直接表達(dá)不帶有前導(dǎo)序列的成熟蛋白質(zhì)需要起始密碼 ， 通常為編碼甲硫氨酸的 ATG。這一菌株對(duì)于表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)而言是一 解決這一問(wèn)題的途徑之一是用大腸桿菌氧硫還蛋白還原酶基因 trxB 缺陷株作為宿主菌表達(dá)目標(biāo)蛋白 。 分泌型異源蛋白的表達(dá) 這是因?yàn)榇竽c桿菌細(xì)胞質(zhì)微環(huán)境的氧化還原態(tài)勢(shì)不利于蛋白質(zhì)二硫鍵的形成 ， 而且缺少一種形成二硫鍵所必須的體系 。 能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括： 清 洗 劑 SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)， 但影響復(fù)性和純化 促 溶 劑 鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜， 但常被自發(fā)