【正文】 會導致翻譯起始效率不同 程度的降低 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響 起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響 大腸桿菌中的起始 tRNA 分子可以同時識別 AUG、 GUG 和 UUG 三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常 GUG 為 AUG 的 50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。 mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5‘ 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為 核糖體結(jié)合位點（ RBS） 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點 大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 6–8 個核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’ 即 ShineDalgarno（ SD） 序列 ， 它通過識別大腸桿菌核糖體小亞 基中的 16S rRNA 3’ 端區(qū)域 3’ AUUCCUCC 5’ 并與之專一性結(jié)合 將 mRNA 定位于核糖體上 ， 從而啟動翻譯； 翻譯起始密碼子 ， 大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的 起始位點 ， 有些基因也使用 GUG 或 UUG 作為翻譯起始密碼子 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區(qū) 5’ 端若干密碼子的堿基序列 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響 SD 序列的影響 一般來說， mRNA 與核糖體的結(jié)合程度越強，翻譯的起始效率就 越高，而這種結(jié)合程度主要取決于 SD （ UAAGGAGG） 序列與 16S rRNA 的堿基互補性，其中以 GGAG 四個堿基序列尤為重要。 能夠在沒有外界的物理 ， 化學信號的介入條件下自動誘導表達目的 基因是這類表達載體的特點 ， 其缺陷是不容易精確控制自動誘導的 時刻 。 在富氧條件下轉(zhuǎn)錄被抑制 ， 在 貧氧或微氧條件下轉(zhuǎn)錄被激活 。 cadA 啟動子受培養(yǎng)基中 H+ 濃度 ， 即 pH 值調(diào)控 。 這兩個啟動子受在培養(yǎng)基中的 無機磷 （ Pi） 濃度調(diào)控 （ Pi﹥ 5mmol/L 時抑制 ， Pi﹤ 1mmol/L 時激活 )， 具有較高的轉(zhuǎn)錄水平 。 解決辦法之一 在表達系統(tǒng)中低水平表達 T7 溶菌酶基因 。 化學誘導型 溫度誘導型 雙質(zhì)粒系統(tǒng) T7 RNA 聚合酶 T7 啟動子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因 ？ 啟動子 T7 表達系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機理 化學誘導型 噬菌體 DE3 是 l 噬菌體的衍生 株 ， 一段含有 lacI、 lacUV5 啟 動子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌體 DE3 的溶源菌作為表 達載體的宿主菌 ， 調(diào)控方式為 化學誘導型 ， 類似于 Lac 表達 系統(tǒng) 。 T7 RNA 聚合酶活性高 ， 其合成 RNA 的速度比大腸桿菌 RNA 聚合 酶快 5倍 左右 。 缺陷 在熱脈沖誘導過程中 ， 大腸桿菌熱休克蛋白的表達也會被激活 ， 其 中一些是蛋白水解酶 ， 有可能降解所表達的重組蛋白 。 因此 PL 、 PR 表達系統(tǒng)都選用 溫度敏感 突變體 cI 857(ts) 的基因產(chǎn)物 來調(diào)控 PL 、 PR 啟動子的轉(zhuǎn)錄 。 在正常的細菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中 往往添加 IAA 誘導 Ptrp 介導的目的基因表達 啟動子 Trp 表達系統(tǒng) 以大腸桿菌 trp 操縱子調(diào)控機理為基礎設計 、 構(gòu)建的表達系統(tǒng) Trp 表達系統(tǒng) Ptrp Otrp RNA 聚合酶 基底水平轉(zhuǎn)錄 高效轉(zhuǎn)錄 mRNA Ptrp Otrp 去除 色氨酸 高效轉(zhuǎn)錄 mRNA Ptrp Otrp 加入 IAA RNA 聚合酶 RNA 聚合酶 PL 和 PR 表達系統(tǒng) 以 l 噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子 PL 、 PR 為核心構(gòu)建的表達系統(tǒng) 在野生型 l 噬菌體中 ， PL 、 PR 啟動子轉(zhuǎn)錄與否決定了 l 噬菌體進入 裂解循環(huán)還是溶源循環(huán) 。 乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用 ， 較多的乳糖存在也 會導致菌體生理及生長特性變化 。 lac、 tac 表達系統(tǒng)存在的問題 IPTG 用于誘導 lac、 tac 啟動子的轉(zhuǎn)錄 ， 但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性 。 lac、 tac 啟動子對宿主菌的要求 為了使以 Lac、 Tac 表達系統(tǒng)具有嚴緊調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄的能力 ， 一 種 能產(chǎn)生過量的 LacI 阻遏蛋白 的 lacI 基因的突變體 lacIq 被應用于表 達系統(tǒng) 。 調(diào)控模式與 lacUV5 相似 ， 但 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平更高 于 trp 和 lacUV5 啟動子 （ P tac = 3 P trp = 11 P lac） ， 因此在要求有較高基因表達 水平的情況下 ， 選用 tac 啟動子比用 lacUV5 啟動子更優(yōu)越 。外源基因在大腸桿菌中的表達 外源基因在大腸桿菌中的表達 大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢 全基因組測序，共有 4405個開放型閱讀框架 基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 被美國 FDA批準為安全的基因工程受體生物 外源基因在大腸桿菌中的表達 大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征 大腸桿菌表達外源基因的劣勢 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復性功能 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白 細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素 外源基因在大腸桿菌中的表達 外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理 啟動子 終止子 核糖體結(jié)合位點 密碼子 質(zhì)粒拷貝數(shù) 轉(zhuǎn)錄 翻譯 P tac = 3 P trp = 11 P lac 啟動子 35 區(qū)序列 10 區(qū)序列 P lac T T T A C A T A T A A T P trp T T G A C A T T A A C T P tac T T G A C A T A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P lL T T G A C A G A T A C T P recA T T G A T A T A T A A T 啟動子 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理 具有多順反子結(jié)構(gòu) ， 基因排列次序為： 啟動子 （ lacP） 操縱基因 （ lacO） 結(jié)構(gòu)基因 （ lacZlacYlacA） 正調(diào)節(jié)因子 CAP 負調(diào)節(jié)因子 lac I 啟動子 Lac 表達系統(tǒng) 以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機理為基礎設計 、 構(gòu)建的表達系統(tǒng) lacI Plac lacO lacZ lacY lacA 高效轉(zhuǎn)錄 cAMP CAP lacI Plac lacO lacZ lacY lacA RNA 聚合酶 基底水平轉(zhuǎn)錄 Lac 表達系統(tǒng) 正調(diào)節(jié)因子 CAP cAMP激活 CAP， CAP–cAMP復合物與 lac 操縱子上專一位點結(jié)合 后，能促進 RNA 聚合酶與 –3 –10 序列的結(jié)合，進而促進 Plac 介導的轉(zhuǎn)錄。 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA RNA 聚合酶 基底水平轉(zhuǎn)錄 lacI Plac lacO lacZ lacY lacA 高效轉(zhuǎn)錄 RNA 聚合酶 IPTG mRNA Tac 表達系統(tǒng) tac 啟動子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –1