【正文】 由此獲得的工程菌同時(shí)具備了穩(wěn)定高效表達(dá)可分泌型融合蛋白的優(yōu)良特性，為胰島素的后續(xù)分離純化工序減輕了負(fù)擔(dān)。 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 A鏈和 B鏈同時(shí)表達(dá)法 tac bGal ori Apr Met Met M M N C B peptide A peptide 化學(xué)合成 AB鏈編碼序列 重組人胰島素 轉(zhuǎn)化 分離純化 CNBr 處理 特異性裂解 體外折疊 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 分泌型重組人胰島素表達(dá)法 上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌 b半乳糖苷酶基因 拼接的方法，所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。雖然這條工藝路線并不比 AB鏈分別表達(dá)法更為簡捷， 而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上 彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產(chǎn)品的成本僅 50美元 。 為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，美國 Ely LiLi公司隨后又建立了第 二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。 上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素 受體結(jié)合 性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代 動(dòng)力學(xué) 等指標(biāo)上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別，而且還具有 無免疫 原性、注射吸收迅速等 優(yōu)點(diǎn)，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域 中的巨大潛力。 人胰島素的生產(chǎn)方法 基因工程法制人胰島素 1982年，美國 Ely LiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島 素，成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。 上述思路的技術(shù)路線是：在 pH為 67的有機(jī)相中使胰蛋白酶催 化其逆反應(yīng)，該酶在過量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素 B 鏈 C末端的丙氨酸交換下來，所形成的人胰島素叔丁酯再用三氯乙 酸脫去叔丁酯基團(tuán)，最終獲得人胰島素。這 條化學(xué)全合成的路線從技術(shù)上來說是能夠做到的，但其生產(chǎn) 成本奇高，從而也限制了產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用。重組質(zhì)粒逃逸的原因有： 高溫培養(yǎng)、表面活性劑（ SDS）、 藥物（利福平）、染料（ 吖啶）促使重組質(zhì)粒滲漏 受體細(xì)胞中的核酸酶降解重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配，細(xì)胞所含重組質(zhì)粒 拷貝數(shù)的差異隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而加劇 改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略 （ 1）改進(jìn)載體受體系統(tǒng) 以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括： 將 R1質(zhì)粒上的 parB基因引入表達(dá)型載體中， 其表達(dá)產(chǎn)物可以 選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細(xì)胞 正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn)， 禁止 DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi) 將受體細(xì)胞的致死性基因安裝在載體上， 同時(shí)構(gòu)建條件致死 性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的 ssb基因（ DNA單鏈結(jié)合 蛋白編碼基因 改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略 （ 2）施加選擇壓力 根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素 藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素 根據(jù)載體上的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份 培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高 改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略 （ 3）控制目的基因的過量表達(dá) 使用可控型啟動(dòng)子控制目的基因的定時(shí)表達(dá)及表達(dá)程度 使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時(shí)增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù) （ 4）優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)工藝 培養(yǎng)基組成： 限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定 培養(yǎng)溫度： 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定 五、 利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素 胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成 人胰島素的生產(chǎn)方法 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建 大腸桿菌基因工程 胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成 S S S S C N S S B 肽（ 30） C 肽（ 31） A 肽（ 21） R R R K S S S S C N S S N C 高爾基體內(nèi)的特異性肽酶 N C 信號(hào)肽 B 肽 C 肽 A 肽 信號(hào)肽酶 人胰島素的生產(chǎn)方法 直接提取法制人胰島素 迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法： 早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分離純化的，由于原料 供應(yīng)的限制，其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增多的糖尿病人的臨 床需求。 相反， N末端含有 Pro、 Glu、 Ser、 Thr的真核生物蛋白質(zhì)，在真核和原核細(xì)胞中的半衰期通常很短 ， 尤其 ProGluSerThr序列（ PEST序列）， 是胞內(nèi)蛋白酶的超敏感區(qū)。更為重要的是，在多種結(jié)構(gòu)和功能相互獨(dú)立的蛋白質(zhì) C末端引入 Asp殘基，都能顯著地延長這些蛋白質(zhì)的半衰期，因此具有普遍意義 。熱休克基因 dnaK、 dnaJ、 groEL、 grpE以及環(huán)境壓力特異性 s因子編碼基因 htpR的突變株均呈現(xiàn)出對(duì)異源蛋白降解作用的嚴(yán)重缺陷，特別是 lonhtpR的雙缺陷株，非常適合高效表達(dá)各種不穩(wěn)定的重組異源蛋白 。 lon的 大腸桿菌突變株可使原來半衰期較短的細(xì)菌調(diào)控蛋白（如 SulA、 RscA、 lN） 穩(wěn)定性大增，因此被廣泛用作外源基因高效表達(dá)的受體菌。 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白是被大腸桿菌中的蛋白酶 La和 Ti降解的，兩者分別由 lon和 clp基因編碼，其蛋白水解活性依賴于 ATP。 在大多數(shù)情況下，重組目的蛋白的不穩(wěn)定性可歸結(jié)為對(duì)受體細(xì)胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。 一般地說 ， 距離越遠(yuǎn) 、 長度越長 、 同源性越高 ， 重組的頻率也就越高 ， 反之亦然 。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高 目的產(chǎn)物回收困難 寡聚短肽需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲最終分子，但 裂解后的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性 寡聚型異源蛋白的表達(dá) 寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 P SD gene gene gene gene T1 T2 H2N COOH Met Met Met Met mRNA CNBr 基本戰(zhàn)略： 寡聚型異源蛋白的表達(dá) 寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 構(gòu)建舉例： P SD T1 T2 EcoRI BamHI AATTCAGATCT GTCTAGA G CCTAG EcoRI Bgl II BamHI EcoRI BamHI Bgl II GATCT A G CCTAG EcoRI BamHI Bgl II EcoRI BamHI Bgl II EcoRI + BamHI Bgl II + BamHI BamHI 整合型異源蛋白的表達(dá) 以整合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn) 目的基因穩(wěn)定表達(dá) 整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體 DNA的復(fù)制而復(fù)制，在大 多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續(xù) 目的基因表達(dá)率低 單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受到限制，此時(shí)可通過強(qiáng)化表達(dá) 元件而加以補(bǔ)償 培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒，這對(duì)以改良物種遺傳性狀為目 的的基因工程案例特別有意義 整合型異源蛋白的表達(dá) DNA體內(nèi)重組的基本原理 在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，廣泛存在著 DNA的遺傳重組機(jī)制，其可能的生物學(xué)功效是促進(jìn)生物種群的進(jìn)化。隨著重組質(zhì)?？截悢?shù)的不斷增加，受體細(xì)胞內(nèi)的大部分能量和原料被用于合成所有的重組質(zhì)粒編碼蛋白，而細(xì)胞的正常生長代謝卻因能量不濟(jì)受到影響，因此通過增加質(zhì)?？截悢?shù)提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。由于 Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物 融合型異源蛋白的表達(dá) 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 多殘基位點(diǎn) 啟動(dòng)子 受體基因 接頭 目的基因 Met Arg Stop Lys Glu IleGluglyArg Arg Lys Glu IleGluglyArg 表達(dá) 親和層析 酶解回收 融合型異源蛋白的表達(dá) 目的蛋白的回收 酶促裂解法： 多殘基位點(diǎn) Pinpoint Xa tac 生物素結(jié)合肽編碼序列 Xa因子識(shí)別位點(diǎn)編碼序列 SP6 T7 Apr ori MCS ATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGC Xa1 Ile Glu Gly Arg