大腸桿菌基因工程(1)(參考版)
2025-05-31 01:42本頁面
【正文】 為了提高人尿激酶原 cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將大腸桿菌的這兩個(gè)tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)的質(zhì)粒上。 外源基因全合成（最常用） 密碼子 選擇相關(guān) tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降 策略：較低拷貝質(zhì)粒（幾個(gè)至數(shù)十個(gè)） 調(diào)控重組質(zhì)粒的擴(kuò)增 質(zhì)?？截悢?shù) 質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制 pCP3擁有一個(gè) 溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子 pCP3 PL MCS Ori 28 ℃ 42℃ Apr 在 28℃ 時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為 60 在 42℃ 時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至 300 600 在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的 CI基 因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活 因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)粒拷 貝數(shù)和基因的表達(dá) 密碼子 宿主對密碼子的偏愛性 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼 子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性。 從 AUG開始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與 mRNA的 5’ 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會(huì)嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。 緊鄰 AUG的前三個(gè)堿基成份對翻譯起始也有影響，對于大腸桿菌 b半乳糖苷酶的 mRNA而言，在這個(gè)位置上最佳的堿基組合是 UAU或 CUU， 如果用 UUC、 UCA或 AGG取代之，則酶的表達(dá)水平低 20倍 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 翻譯起始密碼子及其下游序列 大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn) ， 但有些基因也使用 GUG或 UUG作為翻譯起始密碼子 。 核糖體結(jié)合位點(diǎn) SD序列與起始密碼子之間的距離的影響 ： SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了 mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子 AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的 P位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。 對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用 終止子也可以象啟動(dòng)子那樣，通過特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基因組 DNA中克隆篩選 pCP1 Apr ori Tcr 篩選 Apr、 Tcs的轉(zhuǎn)化子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS） : mRNA 5’ 端非翻譯序列 ,包括 SD、起始密碼子、 SD與起始密碼子間的序列、起始密碼子下游序列。 轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象： RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA序列，形成長短不一的 mRNA混合物。 2)向宿主細(xì)胞引入 T7 融菌酶質(zhì)粒（ pLysS ），結(jié)合并抑制 T7 RNA 聚合酶的基因。用受溶氧濃度控制的啟動(dòng)子調(diào)控 T7 RNA 聚合酶合成，以適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制。 T7啟動(dòng)子調(diào)控模式 T7RNA聚合酶 用不含 T7 RNA 聚合酶的宿主菌克隆目的基因，用 λ CE6 噬菌體侵染宿主細(xì)胞 —— CE6 是 lambda 噬菌體含溫度敏感突變 (cI857ts) 和 pL/pR 啟動(dòng)子控制 T7 RNA 聚合酶的衍生株，在熱誘導(dǎo)條件下可以激活 T7 RNA 聚合酶的合成。 T7啟動(dòng)子調(diào)控模式 1. IPTG誘導(dǎo) T7RNA聚合酶表達(dá) 噬菌體 DE3 （ lambda 噬菌體的衍生株）含有 lacI 抑制基因和位于 lacUV5 啟動(dòng)子下的 T7 RNA 聚合酶基因。 Ptrp A B cI857 PL 目的基因 阻遏作用 Ptrp A B PL 表達(dá) 色氨酸 T7啟動(dòng)子 —— 來自 T7噬菌體的 異源啟動(dòng)子 T7啟動(dòng)子 —— 最成功的啟動(dòng)子 *只有 T7 RNA 聚合酶才能識(shí)別 T7 啟動(dòng)子 * T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大腸桿菌 RNA 聚合 酶的快 5 倍 *由于大腸桿菌本身不含 T7 RNA 聚合酶 ，需要將外源的 T7 RNA 聚 合酶引入宿主菌。 在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去 色氨酸是困難的，因此基因工程
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