基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用(參考版)
2024-08-16 04:30本頁面
【正文】 h),并且對有機氮源的得率提高到138 mg/g,大大縮短了發(fā)酵時間,為該表達(dá)系統(tǒng)的實際應(yīng)用創(chuàng)造了條件。不同的葡萄糖流加方式有各自的優(yōu)點,采用恒速流加葡萄糖的方式,hIFNa2b的表達(dá)量達(dá)到6 540 mg/L,高于目前已知文獻(xiàn)中hIFNa2b的最高表達(dá)量5 200 mg/L。本文通過優(yōu)化補料分批培養(yǎng)時葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表達(dá)量和表達(dá)速率?？梢钥闯鯢B3添加的酵母提取物提供了氨基酸和核苷酸,有利于外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,使hIFNa2b合成速率加快,hIFNa2b對于有機氮源的得率最高,較FB2的20. 5 h大大縮短了時間,提高了hIFNa2b的生產(chǎn)速率,一次性添加有機氮源的操作也比較便捷,在生產(chǎn)上有一定的應(yīng)用價值。h)。 h后,hIFNa2b表達(dá)量即達(dá)到5530mg/L,hIFNa2b最大比生產(chǎn)速率為124 mg/(g圖9 補料分批培養(yǎng)FB3中菌體(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)的變化曲線 Profiles of dry cell weight (◆), residual glucose(■), acetic acid (●) and hIFNa2b (▲) in fedbatch cultivation FB3 (yeast extract was added h)采用恒比供應(yīng)速率流加方式,葡萄糖流速根據(jù)菌體總量變化而變化,能夠較好地滿足細(xì)胞代謝及重組蛋白表達(dá)所需的能量需求,同時也避免了乙酸和殘?zhí)堑姆e累,平均比生產(chǎn)速率為恒速流加時的2倍。初始葡萄糖耗完后,采用恒比供應(yīng)速率( g/(g 誘導(dǎo)前添加有機氮源對hIFNa2b生產(chǎn)水平的影響許多基因工程菌外源基因的表達(dá)顯示出與生長速率相關(guān)的特性,而補料分批培養(yǎng)中,隨著菌體濃度的提高,誘導(dǎo)初期的比生長速率明顯下降,反映了營養(yǎng)的限制。h),大大低于恒pH補料分批培養(yǎng)實驗FB1。因為期望達(dá)到較高的菌體密度,所以生長期較長。h)(g與分批培養(yǎng)相比,雖然hIFNa2b的比生產(chǎn)速率有所下降,但總產(chǎn)量和菌體hIFNa2b含量大幅提高,說明菌體濃度升高有利于提高h(yuǎn)IFNa2b表達(dá)水平,恒pH流加是一種操作方便的流加方式。h) g/(g但是恒pH流加方式下的葡萄糖流加是基于有機氮源的異化代謝引起pH上升,隨著培養(yǎng)基的氮源如氨基酸的逐漸消耗,減少了氨離子的產(chǎn)生,從而不易引起發(fā)酵液pH上升,導(dǎo)致葡萄糖補加速率的降低,使得培養(yǎng)過程中特別是發(fā)酵后期葡萄糖的供應(yīng)不足。h)。h)。誘導(dǎo)初期的2 h內(nèi),hIFNa2b比生產(chǎn)速率為148 mg/(g進(jìn)入恒pH補料階段后,菌體比生長速率下降的趨勢進(jìn)一步明顯, h1。升溫誘導(dǎo)后,菌體生長明顯減慢,升溫后2 h1, h1相差很大,這與誘導(dǎo)時環(huán)境和細(xì)胞生理狀態(tài)有關(guān)。6 h時初始葡萄糖耗盡,溶氧迅速回升,開始用恒pH法補加葡萄糖,即pH高于設(shè)定值時蠕動泵自動加入葡萄糖溶液1 s。圖6 分批培養(yǎng)時菌體(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)的變化曲線 Profiles of dry cell weight (◆), residual glucose(■), acetic acid (●) and hIFNa2b (▲) in batch cultivation 葡萄糖流加對于hIFNa2b生產(chǎn)水平的影響要獲得hIFNa2b的高體積表達(dá)水平,則需維持較高的比生產(chǎn)速率,并且增大菌體密度,流加葡萄糖是一種很好的選擇。h),但由于菌體濃度增大,生產(chǎn)速率達(dá)到363 mg/(Lh),生產(chǎn)速率為275 mg/(LhIFNa2b的表達(dá)水平達(dá)到749 mg/L,。 h升溫誘導(dǎo),此時菌體處于對數(shù)生長期,升溫對于菌體生長的影響并不顯著,表達(dá)初期菌體比生長速率較升溫前略有下降。C)洗滌,然后溶于上樣緩沖液中[12mmol/L、pH TrisHCl,甘油(φ=),SDS( g/L),巰基乙醇(φ=),溴酚蘭( g/L]。取發(fā)酵液于12 000 r/min,4176。乙酸測定采用氣相色譜法[5]。 測定方法菌體濃度測定采用濁度法,測定波長600 nm處的光密度(OD600),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算菌體干重。h)的速率流加葡萄糖；恒比供應(yīng)速率(QG) g/(g補料分批培養(yǎng)過程中,初始葡萄糖耗盡后采用3種不同的葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供應(yīng)速率流加。C,表達(dá)階段控制溫度42176。發(fā)酵罐培養(yǎng) 將二級種子以6%的接種量接入5 L發(fā)酵罐(RIBE5型)中。C下培養(yǎng)10 h,為一級種子?！∨囵B(yǎng)方法種子培養(yǎng) 從20176。未特別注明的補料分批發(fā)酵培養(yǎng)基均為含葡萄糖5 g/L的2LB培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L),補料液為400 g/L的葡萄糖。培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L,NaCl 10 g/L),滅菌后加入100 mg/L氨芐青霉素鈉。考察了補料方式對hIFNa2b生產(chǎn)速率的影響,hIFNa2b表達(dá)水平達(dá)到6 540 mg/L。在大腸桿菌溫度誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白的發(fā)酵過程中,如何控制升溫誘導(dǎo)后菌體的生
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