基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用-全文預(yù)覽
【正文】 由于大腸桿菌繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制，大腸桿菌的分子遺傳學(xué)背景已相當(dāng)明了，不斷完善的基因操作技術(shù)可將大腸桿菌構(gòu)建成為用于異源蛋白生產(chǎn)的分子工廠。四川抗菌素工業(yè)研究所的徐波等以產(chǎn)量性狀為標(biāo)記特征，％。該技術(shù)巧妙地采用了多輪循環(huán)原生質(zhì)體融合技術(shù)，將各種親本制成原生質(zhì)體融合再生再制成原生質(zhì)體融合再生)，即遞歸原生質(zhì)體融合(recursive protoplast fusion)的方法。通過多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高，同時還打破了傳統(tǒng)物種之間由于生殖隔離導(dǎo)致不能重組的界限。Hiraga等開發(fā)的SISDC技術(shù)在組件內(nèi)部引入了限制性內(nèi)切酶識別標(biāo)記，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶代替DNase I產(chǎn)生重排片段。在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地與含不同突變的模板進(jìn)行雜交，使延伸繼續(xù)，并由于模板轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)進(jìn)行直到獲得全長基因片段，重組的程度可以通過調(diào)整時間和溫度來控制。其操作的原理和步驟如圖4。；，在pH。利用PCR過程中出現(xiàn)的堿基錯配進(jìn)行特定基因隨機(jī)誘變的技術(shù)就稱為易錯PCR(Error_prone PCR，簡稱EP—PCR)。在多位點(diǎn)的突變試驗(yàn)中，TAMS誘變技術(shù)應(yīng)該是首選方法。tube megaprimer PCRTAMS定點(diǎn)誘變技術(shù) 2003年，Young等報(bào)道了一種有目的地?cái)U(kuò)增突變鏈的定點(diǎn)誘變技術(shù)(Targeted amplification of mutant strand，TAMS)。這種單管大引物法的優(yōu)點(diǎn)是：實(shí)現(xiàn)了在同一管中先后進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)，大幅簡化了操作步驟，并且省時、省力。在上述2組研究者建立的方法中，后者提出的方案更加巧妙、簡單(圖1)。例如：重疊延伸PCR法(Overlap Extension PCR簡稱EO—PCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重疊延伸PCR(One—stepOverlap Extension PCR，簡稱OOE．PCR)、單管大引物PCR(Single—tube Megaprimer PCR)、快速定點(diǎn)誘變法、多位點(diǎn)環(huán)狀誘變法TAMS(Targeted Amplification of Mutant Strand)定點(diǎn)誘變技術(shù)。(4)重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞：其主要途徑有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射、電穿孔法、快速冷凍法和炭化纖維介導(dǎo)法等?；蚬こ碳夹g(shù)的全部過程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段與基因載體的體外連接、外源基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞和目標(biāo)基因的表達(dá)等主要環(huán)節(jié)。通過轉(zhuǎn)入外源基因，微生物和動、植物細(xì)胞可以產(chǎn)生出自身原來沒有的蛋白質(zhì)。1972年美國的Berg和Jackson等人將猿猴病毒基因組SV 40DNA、λ噬菌體基因以及大腸桿菌半乳糖操縱子在體外重組獲得成功。文中重點(diǎn)介紹了基因工程育種的一般步驟，以及近年來出現(xiàn)的運(yùn)用基因工程進(jìn)行定向育種的主要新技術(shù)：基因的定點(diǎn)突變，易錯PCR，DAN重排及基因組重排。二、 課程設(shè)計(jì)題目描述與要求本文介紹一種二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的一種新型生物技術(shù)——基因工程，介紹其在育種中的應(yīng)用。三、課程設(shè)計(jì)報(bào)告內(nèi)容引言基因工程是二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的一種新型生物技術(shù)，其發(fā)展從根本上改變了生物技術(shù)的研究和開發(fā)應(yīng)用模式。利用這些技術(shù)，可以直接地、有針對性地在DNA分子水平上改造生物的遺傳性狀。基因工程育種基因工程育種是在基因水平上，運(yùn)用人為方法將所需的某一供體生物的遺傳物質(zhì)提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，與載體連接，然后導(dǎo)入另一細(xì)胞，使外源遺傳物質(zhì)在其中進(jìn)行正常復(fù)制和表達(dá)引，與前幾種育種技術(shù)相比，基因工程育種技術(shù)是人們在分子生物學(xué)指導(dǎo)下的一種自覺的、能像工程一樣可預(yù)先設(shè)計(jì)和控制的育種新技術(shù)，它可實(shí)現(xiàn)超遠(yuǎn)緣雜交，因而是最新最有前途的一種育種新技術(shù)。(3)重組子體外構(gòu)建：主要方法有粘性末端連接法、平端連接法、人工接頭連接法和同聚物加尾連接法。近十年來，定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了長足的發(fā)展，并且在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了很多新技術(shù)。該法省去了傳統(tǒng)上以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變中第1輪PCR產(chǎn)物的純化過程，實(shí)現(xiàn)了在同一管中先后進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)的定點(diǎn)突變目標(biāo)。這2條改進(jìn)措施為：(1)在第1輪PCR反應(yīng)中，誘變引物的濃度僅為側(cè)引物的1％，以減少誘變引物在第2輪PCR中的干擾作用；(2)在第l輪PCR反應(yīng)后，亦即第2輪PCR反應(yīng)前，增加5個循環(huán)的不對稱擴(kuò)增，這有利于提高其后的擴(kuò)增效率。圖1 單管大引物PCR過程Figure 1 The process of Single(3)有目的地?cái)U(kuò)增突變鏈：設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(PCR5和PCR3)，使其3′端堿基分別與錨錠引物引入的突變堿基配對，擴(kuò)增引物只能退火到突變鏈而不是親本鏈。圖2 TAMS定點(diǎn)誘變技術(shù)原理和操作過程Figure 2 The principle and operation process of TAMS1． 易錯PCRDNA聚合酶在進(jìn)行擴(kuò)增目的DNA時會以一定的頻率發(fā)生堿基錯配，這一現(xiàn)象恰好提供了一種對特定基因進(jìn)行隨機(jī)誘變的
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