【正文】 用前景。之后，應(yīng)用基因工程育種技術(shù)重組大腸桿菌BL21(pBAI)生產(chǎn)人干擾素a2b, 通過優(yōu)化補料分批培養(yǎng)時葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表達量和表達速率。(5)重組體篩選和鑒定：以合適的篩選方法選擇具有最佳性能的突變重組子，重組體篩選和鑒定主要通過表型法、DNA鑒定篩選法，選擇性載體篩選法、分子雜交選擇法、免疫學(xué)方法和mRNA翻譯檢測法等方法來實現(xiàn)。該技術(shù)能夠一次引入多個位點的突變，并且能夠有目的地擴增突變鏈，從而使突變效率幾乎達到100％。圖4 DNA重排的原理及操作步驟Figure 4 The principle and operation process of DNA shufflingZhao等在此基礎(chǔ)上發(fā)明了一種更加簡化交叉延伸程序( STEP)(圖5)。Zhang等于2002年首次報道應(yīng)用基因組重排方法快速地使弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)產(chǎn)生泰樂菌素的能力得到提高。本文采用大腸桿菌BL21(pBAI)表達hIFNa2b,其表達通過溫控型PL啟動子調(diào)控。； g/(Lh)；誘導(dǎo)后期比生產(chǎn)速率下降至95 mg/(g在恒pH補料分批培養(yǎng)中,能較好地控制葡萄糖的流加,使得發(fā)酵后期沒有乙酸積累。h))的方式補充葡萄糖,發(fā)酵過程記為FB3,結(jié)果見圖9和表1。恒比供應(yīng)速率流加葡萄糖并在誘導(dǎo)前添加酵母抽提物,雖然總表達量5 530 mg/L,稍低于恒速流加方式,但是平均hIFNa2b生產(chǎn)速率高達1 006 mg/(L通過恒速補糖方式取得了hIFNa2b非常高的表達量,但這是通過延長發(fā)酵時間和提高菌體濃度實現(xiàn)的,過低的比生產(chǎn)速率大大影響發(fā)酵生產(chǎn)效率。h),生產(chǎn)速率高達730 mg/(L分批發(fā)酵中葡萄糖耗完時, g/L。 L，生長階段控制溫度30176。人干擾素a2b (Human Interferona2b,hIFNa2b)是由165個氨基酸組成的多肽,具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)DNA結(jié)構(gòu)損傷等作用。1． 基因組重排基因組重排(genome shufling)技術(shù)是受DNA重排的啟發(fā)，于2l世紀出現(xiàn)的全基因組改組技術(shù)。圖3 易錯PCR示意圖Figure 3 Sketch of errorprone PCR1． DAN重排DNA重排(DNA shufling)技術(shù)是一種利用重組文庫的體外定向進化技術(shù)，Stemmer于1993年首先提出。在對多個樣品進行操作時，該方法的優(yōu)點更為突出。 基因工程育種的一般步驟是：(1)目的基因的獲得：一般通過化學(xué)合成法、物理化學(xué)法(包括密度梯度離心法、單鏈酶法、分子雜交法)、鳥槍無性繁殖法、酶促合成法(逆轉(zhuǎn)錄法)、Norther雜交分析法、cDNA文庫篩選法、雜交篩選法、編碼序列富集(磁珠捕獲)、產(chǎn)物導(dǎo)向法、Nod連接片段篩選法、外顯子捕獲法及外顯子擴增法、剪接位點篩選法、作圖克隆法、雜交細胞克隆法、消減雜交法、相同序列克隆法、差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR法、顯微克隆與微克隆法和插入誘變法等方法獲得目的基因。基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用一、 課程設(shè)計目的 了解工業(yè)生產(chǎn)中的新型育種技術(shù)并比較不同育種技術(shù)的優(yōu)勢；學(xué)習(xí)理解基因工程育種技術(shù)及其操作原理；研究基因工程育種技術(shù)在人干擾素生產(chǎn)中的創(chuàng)新。(2)載體的選擇：基因工程載體主要是質(zhì)粒和病毒，載體一般為環(huán)狀DNA，其要求有自我復(fù)制能力、分子小、拷貝數(shù)多、易連接和易篩選等特點。在以PCR為基礎(chǔ)的誘變方法中，該法是引入單位點突變最簡單、最經(jīng)濟的方法。DNA重排的基本原理是首先將同源基因(單一基因的突變體或基因家族)切成隨機大小的DAN片段，然后進行PCR重聚。這種技術(shù)將分子定向進化的對象從單個基因擴展到整個基因組，可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對菌種的目的性狀進行優(yōu)化組合。hIFNa2b在臨床上廣泛應(yīng)用,對肝炎、呼吸道病毒感染、皰疹病毒感染等均具有治療作用。C,表達階段控制溫度42176。hIFNa2b的表達水平達到749 mg/L,。h)。　誘導(dǎo)前添加有機氮源對hIFNa2b生產(chǎn)水平的影響許多基因工程菌外源基因的表達顯示出與生長速率相關(guān)的特性,而補料分批培養(yǎng)中,隨著菌體濃度的提高,誘導(dǎo)初期的比生長速率明顯下降,反映了營養(yǎng)的限制。h),并且對有機氮源的得率提高到138 mg/g,大大縮短了發(fā)酵時間,為該表達系統(tǒng)的實際應(yīng)用創(chuàng)造了條件。初始葡萄糖耗完后,采用恒比供應(yīng)速率( g/(gh)。h),生產(chǎn)速率為275 mg/(L補料分批培養(yǎng)過程中,初始葡萄糖耗盡后采用3種不同的葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供應(yīng)速率流加。在大腸桿菌溫度誘導(dǎo)表達外源蛋白的發(fā)酵過程中,如何控制升溫誘導(dǎo)后菌體的生長,提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率,是實現(xiàn)高密度高表達的關(guān)鍵。該技術(shù)巧妙地采用了多輪循環(huán)原生質(zhì)體融合技術(shù)，將各種親本制成原生質(zhì)體融合再生再制成原生質(zhì)體融合再生)，即遞歸原生質(zhì)體融合(recursive protoplast fusion)的方法。其操作的原理和步驟如圖4。tube megaprimer PCRTAMS定點誘變技術(shù) 2003年，Young