基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用(編輯修改稿)
2024-09-01 04:30 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 該技術(shù)的用途。Hiraga等開發(fā)的SISDC技術(shù)在組件內(nèi)部引入了限制性內(nèi)切酶識別標(biāo)記，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶代替DNase I產(chǎn)生重排片段。Bergquist等開發(fā)的DOGS技術(shù)則是根據(jù)保守模體區(qū)序列特征設(shè)計簡并引物，擴(kuò)增出保守同源區(qū)后再用重排操作生成突變富集體。由于此方法是在突變耐受的保守區(qū)直接增加轉(zhuǎn)轍組的幾率，所以其產(chǎn)生的突變頻率大大增加。DNA重排的最大特點是在反復(fù)突變過程中引進(jìn)了重組這一自然進(jìn)化中最重要的過程，而且其對可操作的靶序列的長度沒有任何要求，可以達(dá)到幾萬kb。通過多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導(dǎo)致功能的明顯提高，同時還打破了傳統(tǒng)物種之間由于生殖隔離導(dǎo)致不能重組的界限。1． 基因組重排基因組重排(genome shufling)技術(shù)是受DNA重排的啟發(fā)，于2l世紀(jì)出現(xiàn)的全基因組改組技術(shù)。這種技術(shù)將分子定向進(jìn)化的對象從單個基因擴(kuò)展到整個基因組，可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對菌種的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。首先，利用經(jīng)典的誘變育種技術(shù)獲得含有目標(biāo)性狀的基因組庫，然后利用原生質(zhì)體融合技術(shù)將這些發(fā)生正向突變的菌株的全基因組進(jìn)行多輪隨機(jī)重組，從而快速篩選表型得到較大改進(jìn)的雜交菌種。該技術(shù)巧妙地采用了多輪循環(huán)原生質(zhì)體融合技術(shù)，將各種親本制成原生質(zhì)體融合再生再制成原生質(zhì)體融合再生)，即遞歸原生質(zhì)體融合(recursive protoplast fusion)的方法。Zhang等于2002年首次報道應(yīng)用基因組重排方法快速地使弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)產(chǎn)生泰樂菌素的能力得到提高。該方法以營養(yǎng)缺陷型為出發(fā)菌株，僅用了1年時間，通過兩輪基因組改組就從24 000株菌株中分離到2組共14株泰樂菌素高產(chǎn)菌株，其泰樂菌素產(chǎn)量高于通過經(jīng)典誘變育種方法所篩得的生產(chǎn)菌株SF21，而后者(SF21)是用經(jīng)典誘變育種方法在長達(dá)20年的時間中先后篩選過約1 000 000個菌株后才獲得的。由此可見，此技術(shù)大大減少了工作量，并縮短了篩選時間。四川抗菌素工業(yè)研究所的徐波等以產(chǎn)量性狀為標(biāo)記特征，％。除上述技術(shù)外，近年來又出現(xiàn)了一些新技術(shù)，例如：部分基因片段改組、單鏈DNA家族改組(SSDNAs)、簡并引物基因改組(DOGS)、瞬時模板的隨機(jī)嵌合、單向引物的隨機(jī)重組、自我復(fù)制、體外隨機(jī)引發(fā)重組(RPR)、酶法體外隨機(jī)定位誘變(random—site—directed mutagenesis)、交錯延伸剪接PCR等。基因工程育種技術(shù)在大腸桿菌種的應(yīng)用大腸桿菌是迄今為止研究的最為詳盡的原核細(xì)菌，其K12MG1655株的4 000多kb的染色體DNA已測序完畢，全基因共含有4 405個開放閱讀框，其中大部分基因的生物功能已被鑒定。作為一種成熟的基因克隆表達(dá)受體，大腸桿菌被廣泛用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，如基因的分離擴(kuò)增、DNA序列分析、基因的表達(dá)產(chǎn)物功能鑒定等。由于大腸桿菌繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制，大腸桿菌的分子遺傳學(xué)背景已相當(dāng)明了，不斷完善的基因操作技術(shù)可將大腸桿菌構(gòu)建成為用于異源蛋白生產(chǎn)的分子工廠。因此，利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌工程菌，以規(guī)模化生產(chǎn)真核生物基因尤其是人類基因的表達(dá)產(chǎn)物，具有重大的經(jīng)濟(jì)價值。現(xiàn)在已有100多種異源蛋白通過大腸桿菌基因工程菌實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜的人體蛋白，如HAS、proUK、MT、MCSF及Hb等。工業(yè)中常用于生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白如人胰島素、人生長激素、人干擾素、人白細(xì)胞介素和抗體。以下以生產(chǎn)人干擾素為例介紹其應(yīng)用。人干擾素a2b (Human Interferona2b,hIFNa2b)是由165個氨基酸組成的多肽,具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)DNA結(jié)構(gòu)損傷等作用。hIFNa2b在臨床上廣泛應(yīng)用,對肝炎、呼吸道病毒感染、皰疹病毒感染等均具有治療作用。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長快速、發(fā)酵成本低、表達(dá)水平高等優(yōu)點,是生產(chǎn)外源蛋白的理想表達(dá)體系。在大腸桿菌溫度誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白的發(fā)酵過程中,如何控制升溫誘導(dǎo)后菌體的生長,提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率,是實現(xiàn)高密度高表達(dá)的關(guān)鍵。本文采用大腸桿菌BL21(pBAI)表達(dá)hIFNa2b,其表達(dá)通過溫控型PL啟動子調(diào)控?？疾炝搜a(bǔ)料方式對hIFNa2b生產(chǎn)速率的影響,hIFNa2b表達(dá)水平達(dá)到6 540 mg/L。 材料與方法 材料菌株 宿主菌E. coli BL21(DE3)[BFdcm ompT hsdS (rBmB) galλ(DE3)],重組質(zhì)粒為pBAI,帶有氨芐青霉素耐藥性標(biāo)記,hIFNa2b基因表達(dá)受λPL啟動子和質(zhì)粒cI857編碼的蛋白調(diào)控。培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L,NaCl 10 g/L),滅菌后加入100 mg/L氨芐青霉素鈉。分批發(fā)酵培養(yǎng)基為含葡萄糖5 g/L的LB培養(yǎng)基。未特別注明的補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)基均為含葡萄糖5 g/L的2LB培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L),補(bǔ)料液為400 g/L的葡萄糖。培養(yǎng)基配制所用蛋白胨和酵母抽提物均為Oxoid產(chǎn)品,其余試劑為國產(chǎn)分析純,采用去離子水配制?！∨囵B(yǎng)方法種子培養(yǎng) 從20176。C
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