干擾素的生產工藝(編輯修改稿)
2025-03-26 01:53 本頁面
【文章內容簡介】 結構和生物活性 工藝特點： 發(fā)酵周期短：幾個小時 無需變性、復性過程，獲得有活性產品 純化過程：淘汰抗體親和層析 基因工程假單胞桿菌的構建與保藏 ? 基因工程假單胞桿菌菌種建立： ? 第一步：干擾素 α2b基因的克隆 ? 第二步：表達載體的構建 ? 第三步：工程菌的構建 第一步：干擾素 α2b基因的克隆 制備白細胞，病毒誘導，分離 mRNA,反錄酶合成 cDNA,PCR， 基因連接質粒 , 轉化 ,篩選鑒定克隆。 測序：編碼人 IFNα 2b基因序列 ,501bp，165aa。 第二步：表達載體的構建 IFN基因與表達載體連接 轉化大腸桿菌 篩選陽性克隆 獲得序列正確表達載體 第三步：工程菌的構建 ? 轉化假單胞桿 ? 篩選高表達、穩(wěn)定遺傳的工程菌 ? 獲得原始菌種 菌種庫的建立與保藏 QC：菌種特性、生產能力、質粒穩(wěn)定性 菌種檢查合格后，方可投產。 干擾素 α2b的發(fā)酵工藝過程 搖瓶培養(yǎng)： ? 取保存工作種子批菌種，室溫融化 ? 搖瓶培養(yǎng)： 30℃ ， ， 250 r/min，18177。 2h ? 檢測： OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。 種子罐培養(yǎng)： 接種：接入 50L種子罐，接種量 10%。 培養(yǎng)： 30℃ ， 。 控制：級聯調節(jié)通氣量和攪拌轉速 檢測：顯微鏡和 LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。 發(fā)酵罐培養(yǎng)： ?接種：通入 300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%。 ?控制：級聯調節(jié)通氣量和攪拌轉速。 ?前 4h： 30℃ ， ， DO為 30%。 ?4h后： 20℃ ， ， DO為 60%， 5～ 。 ?終點控制： OD值達 177。 ， 5℃ 冷卻水快速降溫至 15℃ 以下。 ?檢測：發(fā)酵液雜菌檢查 菌體收集： 連續(xù)流離心機：冷卻的發(fā)酵液， 16000 r/min離心收集。 菌體保存：－ 20℃ 冰柜，不超過 12個月。 檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質粒結構一致性、質粒穩(wěn)定性。 干擾素 α2b分離工藝過程 ? 菌體裂解 ? 預處理 ? 離心 ? 初級分離 ： 裂解緩沖液：純化水配制， 2℃ ～ 10℃（ ） 使用保護劑： EDTA， PMSF。 破碎－ 20℃ 菌體： 2厘米以下的碎塊 攪拌：加裂解緩沖液， 2℃ ～ 10℃ ， 2hr 凍融 : 細胞完全破裂，釋放干擾素。 沉淀： ? 加絮凝劑聚乙烯亞胺 : 2℃ ～ 10℃ ，攪拌 45min，對菌體碎片進行絮凝。 ? 加凝聚劑醋酸鈣溶液 : 2℃ ～ 10℃ ,攪拌 15min，對菌體碎片、 DNA等進行沉淀。 ： 連續(xù)流離心機： 2℃ ～ 10℃ ， 16000 r/min 收集上清液：含
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