基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用(存儲(chǔ)版)
【正文】 誘導(dǎo)時(shí)環(huán)境和細(xì)胞生理狀態(tài)有關(guān)。h)。h)(g初始葡萄糖耗完后,采用恒比供應(yīng)速率( g/(g可以看出FB3添加的酵母提取物提供了氨基酸和核苷酸,有利于外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,使hIFNa2b合成速率加快,hIFNa2b對于有機(jī)氮源的得率最高,較FB2的20. 5 h大大縮短了時(shí)間,提高了hIFNa2b的生產(chǎn)速率,一次性添加有機(jī)氮源的操作也比較便捷,在生產(chǎn)上有一定的應(yīng)用價(jià)值。h),并且對有機(jī)氮源的得率提高到138 mg/g,大大縮短了發(fā)酵時(shí)間,為該表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用創(chuàng)造了條件。h)。 誘導(dǎo)前添加有機(jī)氮源對hIFNa2b生產(chǎn)水平的影響許多基因工程菌外源基因的表達(dá)顯示出與生長速率相關(guān)的特性,而補(bǔ)料分批培養(yǎng)中,隨著菌體濃度的提高,誘導(dǎo)初期的比生長速率明顯下降,反映了營養(yǎng)的限制。與分批培養(yǎng)相比,雖然hIFNa2b的比生產(chǎn)速率有所下降,但總產(chǎn)量和菌體hIFNa2b含量大幅提高,說明菌體濃度升高有利于提高h(yuǎn)IFNa2b表達(dá)水平,恒pH流加是一種操作方便的流加方式。h)。6 h時(shí)初始葡萄糖耗盡,溶氧迅速回升,開始用恒pH法補(bǔ)加葡萄糖,即pH高于設(shè)定值時(shí)蠕動(dòng)泵自動(dòng)加入葡萄糖溶液1 s。hIFNa2b的表達(dá)水平達(dá)到749 mg/L,。乙酸測定采用氣相色譜法[5]。C,表達(dá)階段控制溫度42176。未特別注明的補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)基均為含葡萄糖5 g/L的2LB培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L),補(bǔ)料液為400 g/L的葡萄糖。hIFNa2b在臨床上廣泛應(yīng)用,對肝炎、呼吸道病毒感染、皰疹病毒感染等均具有治療作用?；蚬こ逃N技術(shù)在大腸桿菌種的應(yīng)用大腸桿菌是迄今為止研究的最為詳盡的原核細(xì)菌，其K12MG1655株的4 000多kb的染色體DNA已測序完畢，全基因共含有4 405個(gè)開放閱讀框，其中大部分基因的生物功能已被鑒定。這種技術(shù)將分子定向進(jìn)化的對象從單個(gè)基因擴(kuò)展到整個(gè)基因組，可以在更為廣泛的范圍內(nèi)對菌種的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。圖5 交叉延伸程序的基本過程Figure 5 Basic procedure of staggered extension process近幾年來，提高DNA重排技術(shù)捕獲變異的能力一直是研究人員努力的方向。DNA重排的基本原理是首先將同源基因(單一基因的突變體或基因家族)切成隨機(jī)大小的DAN片段，然后進(jìn)行PCR重聚。例如，利用定點(diǎn)突變改變酪氨酰tRNA合成酶的活性中心，從而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫鍵，顯著提高了該酶的穩(wěn)定性。在以PCR為基礎(chǔ)的誘變方法中，該法是引入單位點(diǎn)突變最簡單、最經(jīng)濟(jì)的方法。單管大引物PCR Picard等和HKe等分別建立了單管大引物PCR法。(2)載體的選擇：基因工程載體主要是質(zhì)粒和病毒，載體一般為環(huán)狀DNA，其要求有自我復(fù)制能力、分子小、拷貝數(shù)多、易連接和易篩選等特點(diǎn)。在二十世紀(jì)八十年代以來，隨著大批大批成果的出現(xiàn)及應(yīng)用，基因工程帶來了一場新的革命?；蚬こ碳捌湓诖竽c桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用一、 課程設(shè)計(jì)目的 了解工業(yè)生產(chǎn)中的新型育種技術(shù)并比較不同育種技術(shù)的優(yōu)勢；學(xué)習(xí)理解基因工程育種技術(shù)及其操作原理；研究基因工程育種技術(shù)在人干擾素生產(chǎn)中的創(chuàng)新。翌年，美國斯坦佛大學(xué)的Cohen和Boyer等人在體外構(gòu)建出含有四環(huán)素和鏈霉素連個(gè)抗性基因的重組質(zhì)粒分子，將之導(dǎo)入大腸桿菌后，該重組質(zhì)粒得以穩(wěn)定復(fù)制，并賦予受體細(xì)胞相應(yīng)的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的誕生。 基因工程育種的一般步驟是：(1)目的基因的獲得：一般通過化學(xué)合成法、物理化學(xué)法(包括密度梯度離心法、單鏈酶法、分子雜交法)、鳥槍無性繁殖法、酶促合成法(逆轉(zhuǎn)錄法)、Norther雜交分析法、cDNA文庫篩選法、雜交篩選法、編碼序列富集(磁珠捕獲)、產(chǎn)物導(dǎo)向法、Nod連接片段篩選法、外顯子捕獲法及外顯子擴(kuò)增法、剪接位點(diǎn)篩選法、作圖克隆法、雜交細(xì)胞克隆法、消減雜交法、相同序列克隆法、差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR法、顯微克隆與微克隆法和插入誘變法等方法獲得目的基因。在這些技術(shù)中，單管大引物PCRTAMS定點(diǎn)誘變技術(shù)最為簡單和適用，并得到廣泛的應(yīng)用。在對多個(gè)樣品進(jìn)行操作時(shí)，該方法的優(yōu)點(diǎn)更為突出。定點(diǎn)突變技術(shù)已在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改造上取得了很大成功。圖3 易錯(cuò)PCR示意圖Figure 3 Sketch of errorprone PCR1． DAN重排DNA重排(DNA shufling)技術(shù)是一種利用重組文庫的體外定向進(jìn)化技術(shù)，Stemmer于1993年首先提出。此方法省去了將DNA酶切成片段這一步，致使DNA重排方法進(jìn)一步簡化。1． 基因組重排基因組重排(genome shufling)技術(shù)是受DNA重排的啟發(fā)，于2l世紀(jì)出現(xiàn)的全基因組改組技術(shù)。除上述技術(shù)外，近年來又出現(xiàn)了一些新技術(shù)，例如：部分基因片段改組、單鏈DNA家族改組(SSDNAs)、簡并引物基因改組(DOGS)、瞬時(shí)模板的隨機(jī)嵌合、單向引物的隨機(jī)重組、自我復(fù)制、體外隨機(jī)引發(fā)重組(RPR)、酶法體外隨機(jī)定位誘變(random—site—directe
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