基因工程及其在大腸桿菌生產人干擾素中的應用(存儲版)
【正文】 誘導時環(huán)境和細胞生理狀態(tài)有關。h)。h)(g初始葡萄糖耗完后,采用恒比供應速率( g/(g可以看出FB3添加的酵母提取物提供了氨基酸和核苷酸,有利于外源基因的轉錄和翻譯,使hIFNa2b合成速率加快,hIFNa2b對于有機氮源的得率最高,較FB2的20. 5 h大大縮短了時間,提高了hIFNa2b的生產速率,一次性添加有機氮源的操作也比較便捷,在生產上有一定的應用價值。h),并且對有機氮源的得率提高到138 mg/g,大大縮短了發(fā)酵時間,為該表達系統(tǒng)的實際應用創(chuàng)造了條件。h)?！≌T導前添加有機氮源對hIFNa2b生產水平的影響許多基因工程菌外源基因的表達顯示出與生長速率相關的特性,而補料分批培養(yǎng)中,隨著菌體濃度的提高,誘導初期的比生長速率明顯下降,反映了營養(yǎng)的限制。與分批培養(yǎng)相比,雖然hIFNa2b的比生產速率有所下降,但總產量和菌體hIFNa2b含量大幅提高,說明菌體濃度升高有利于提高hIFNa2b表達水平,恒pH流加是一種操作方便的流加方式。h)。6 h時初始葡萄糖耗盡,溶氧迅速回升,開始用恒pH法補加葡萄糖,即pH高于設定值時蠕動泵自動加入葡萄糖溶液1 s。hIFNa2b的表達水平達到749 mg/L,。乙酸測定采用氣相色譜法[5]。C,表達階段控制溫度42176。未特別注明的補料分批發(fā)酵培養(yǎng)基均為含葡萄糖5 g/L的2LB培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L,酵母抽提物10 g/L,NaCl 10 g/L),補料液為400 g/L的葡萄糖。hIFNa2b在臨床上廣泛應用,對肝炎、呼吸道病毒感染、皰疹病毒感染等均具有治療作用?；蚬こ逃N技術在大腸桿菌種的應用大腸桿菌是迄今為止研究的最為詳盡的原核細菌，其K12MG1655株的4 000多kb的染色體DNA已測序完畢，全基因共含有4 405個開放閱讀框，其中大部分基因的生物功能已被鑒定。這種技術將分子定向進化的對象從單個基因擴展到整個基因組，可以在更為廣泛的范圍內對菌種的目的性狀進行優(yōu)化組合。圖5 交叉延伸程序的基本過程Figure 5 Basic procedure of staggered extension process近幾年來，提高DNA重排技術捕獲變異的能力一直是研究人員努力的方向。DNA重排的基本原理是首先將同源基因(單一基因的突變體或基因家族)切成隨機大小的DAN片段，然后進行PCR重聚。例如，利用定點突變改變酪氨酰tRNA合成酶的活性中心，從而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫鍵，顯著提高了該酶的穩(wěn)定性。在以PCR為基礎的誘變方法中，該法是引入單位點突變最簡單、最經濟的方法。單管大引物PCR Picard等和HKe等分別建立了單管大引物PCR法。(2)載體的選擇：基因工程載體主要是質粒和病毒，載體一般為環(huán)狀DNA，其要求有自我復制能力、分子小、拷貝數多、易連接和易篩選等特點。在二十世紀八十年代以來，隨著大批大批成果的出現及應用，基因工程帶來了一場新的革命?；蚬こ碳捌湓诖竽c桿菌生產人干擾素中的應用一、 課程設計目的 了解工業(yè)生產中的新型育種技術并比較不同育種技術的優(yōu)勢；學習理解基因工程育種技術及其操作原理；研究基因工程育種技術在人干擾素生產中的創(chuàng)新。翌年，美國斯坦佛大學的Cohen和Boyer等人在體外構建出含有四環(huán)素和鏈霉素連個抗性基因的重組質粒分子，將之導入大腸桿菌后，該重組質粒得以穩(wěn)定復制，并賦予受體細胞相應的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的誕生。 基因工程育種的一般步驟是：(1)目的基因的獲得：一般通過化學合成法、物理化學法(包括密度梯度離心法、單鏈酶法、分子雜交法)、鳥槍無性繁殖法、酶促合成法(逆轉錄法)、Norther雜交分析法、cDNA文庫篩選法、雜交篩選法、編碼序列富集(磁珠捕獲)、產物導向法、Nod連接片段篩選法、外顯子捕獲法及外顯子擴增法、剪接位點篩選法、作圖克隆法、雜交細胞克隆法、消減雜交法、相同序列克隆法、差異顯示逆轉錄PCR法、顯微克隆與微克隆法和插入誘變法等方法獲得目的基因。在這些技術中，單管大引物PCRTAMS定點誘變技術最為簡單和適用，并得到廣泛的應用。在對多個樣品進行操作時，該方法的優(yōu)點更為突出。定點突變技術已在蛋白質的結構和功能改造上取得了很大成功。圖3 易錯PCR示意圖Figure 3 Sketch of errorprone PCR1． DAN重排DNA重排(DNA shufling)技術是一種利用重組文庫的體外定向進化技術，Stemmer于1993年首先提出。此方法省去了將DNA酶切成片段這一步，致使DNA重排方法進一步簡化。1． 基因組重排基因組重排(genome shufling)技術是受DNA重排的啟發(fā)，于2l世紀出現的全基因組改組技術。除上述技術外，近年來又出現了一些新技術，例如：部分基因片段改組、單鏈DNA家族改組(SSDNAs)、簡并引物基因改組(DOGS)、瞬時模板的隨機嵌合、單向引物的隨機重組、自我復制、體外隨機引發(fā)重組(RPR)、酶法體外隨機定位誘變(random—site—directe
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