基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用-文庫吧
2025-07-21 04:30 本頁面
【正文】 建立了單管大引物PCR法。該法省去了傳統(tǒng)上以PCR為基礎(chǔ)的定點(diǎn)突變中第1輪PCR產(chǎn)物的純化過程，實現(xiàn)了在同一管中先后進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)的定點(diǎn)突變目標(biāo)。在上述2組研究者建立的方法中，后者提出的方案更加巧妙、簡單(圖1)。其只需設(shè)計Tm值不同的2個側(cè)引物，在第1輪PCR反應(yīng)中用Tm值低的側(cè)引物(F1)和誘變引物，在較低的退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大引物；然后再加入Tm值高的側(cè)引物(F2)，在較高的退火溫度下進(jìn)行第2輪反應(yīng)，擴(kuò)增出含突變位點(diǎn)的整個DNA產(chǎn)物。Ke等在此方法中還提出了2條更為細(xì)致、有效的改進(jìn)措施，使PCR產(chǎn)物的最終產(chǎn)量和純度均有所提高。這2條改進(jìn)措施為：(1)在第1輪PCR反應(yīng)中，誘變引物的濃度僅為側(cè)引物的1％，以減少誘變引物在第2輪PCR中的干擾作用；(2)在第l輪PCR反應(yīng)后，亦即第2輪PCR反應(yīng)前，增加5個循環(huán)的不對稱擴(kuò)增，這有利于提高其后的擴(kuò)增效率。這種單管大引物法的優(yōu)點(diǎn)是：實現(xiàn)了在同一管中先后進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)，大幅簡化了操作步驟，并且省時、省力。在對多個樣品進(jìn)行操作時，該方法的優(yōu)點(diǎn)更為突出。在以PCR為基礎(chǔ)的誘變方法中，該法是引入單位點(diǎn)突變最簡單、最經(jīng)濟(jì)的方法。圖1 單管大引物PCR過程Figure 1 The process of Singletube megaprimer PCRTAMS定點(diǎn)誘變技術(shù) 2003年，Young等報道了一種有目的地擴(kuò)增突變鏈的定點(diǎn)誘變技術(shù)(Targeted amplification of mutant strand，TAMS)。該技術(shù)能夠一次引入多個位點(diǎn)的突變，并且能夠有目的地擴(kuò)增突變鏈，從而使突變效率幾乎達(dá)到100％。該方法主要分3步(圖2)：(1)線性單鏈DNA模板的制備：通過線性PCR制備單鏈DNA模板；(2)突變鏈的合成：該步驟需用2個錨錠引物(即Anchor5和Anchor3)和多個誘變引物(Mut1和Mut2)。(3)有目的地擴(kuò)增突變鏈：設(shè)計擴(kuò)增引物(PCR5和PCR3)，使其3′端堿基分別與錨錠引物引入的突變堿基配對，擴(kuò)增引物只能退火到突變鏈而不是親本鏈。在多位點(diǎn)的突變試驗中，TAMS誘變技術(shù)應(yīng)該是首選方法。定點(diǎn)突變技術(shù)已在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改造上取得了很大成功。例如，利用定點(diǎn)突變改變酪氨酰tRNA合成酶的活性中心，從而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫鍵，顯著提高了該酶的穩(wěn)定性。圖2 TAMS定點(diǎn)誘變技術(shù)原理和操作過程Figure 2 The principle and operation process of TAMS1． 易錯PCRDNA聚合酶在進(jìn)行擴(kuò)增目的DNA時會以一定的頻率發(fā)生堿基錯配，這一現(xiàn)象恰好提供了一種對特定基因進(jìn)行隨機(jī)誘變的可能方法。利用PCR過程中出現(xiàn)的堿基錯配進(jìn)行特定基因隨機(jī)誘變的技術(shù)就稱為易錯PCR(Error_prone PCR，簡稱EP—PCR)。此方法的原理與操作如圖3，其操作過程是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反應(yīng)體系中，利用Mn替代天然的輔助因子Mg，使Taq DNA聚合酶缺乏校對活性，同時使反應(yīng)體系中各種dNTP的比例失衡，因此導(dǎo)致堿基的錯配率大大增加，％。另外，還可以在該反應(yīng)體系中加入dITP等三磷酸脫氧核苷類似物來控制錯配水平。這種方法可以將錯配率最大提高至20％。；，在pH。圖3 易錯PCR示意圖Figure 3 Sketch of errorprone PCR1． DAN重排DNA重排(DNA shufling)技術(shù)是一種利用重組文庫的體外定向進(jìn)化技術(shù)，Stemmer于1993年首先提出。DNA重排的基本原理是首先將同源基因(單一基因的突變體或基因家族)切成隨機(jī)大小的DAN片段，然后進(jìn)行PCR重聚。那些帶有同源性和核苷酸序列差異的隨機(jī)DAN片段在每一輪循環(huán)中互為引物和模板，經(jīng)過多次PCR循環(huán)后能迅速產(chǎn)生大量的重組DNA，從而創(chuàng)造出新基因。其操作的原理和步驟如圖4。圖4 DNA重排的原理及操作步驟Figure 4 The principle and operation process of DNA shufflingZhao等在此基礎(chǔ)上發(fā)明了一種更加簡化交叉延伸程序( STEP)(圖5)。此技術(shù)是在一個PCR反應(yīng)體系中以2個以上相關(guān)的DNA片段為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物先在一個模板鏈上延伸，隨之進(jìn)行多輪變性、短暫復(fù)性(延伸)過程。在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機(jī)地與含不同突變的模板進(jìn)行雜交，使延伸繼續(xù)，并由于模板轉(zhuǎn)換而實現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)進(jìn)行直到獲得全長基因片段，重組的程度可以通過調(diào)整時間和溫度來控制。此方法省去了將DNA酶切成片段這一步，致使DNA重排方法進(jìn)一步簡化。圖5 交叉延伸程序的基本過程Figure 5 Basic procedure of staggered extension process近幾年來，提高DNA重排技術(shù)捕獲變異的能力一直是研究人員努力的方向。Ostermie等以核酸外切酶Ⅱ代替DNaseI對靶序列進(jìn)行消化，發(fā)明了遞減法建立雜交酶技術(shù)（ITCHY)，使得非同源性序列間也能發(fā)生重排，擴(kuò)大了
黨政相關(guān)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1