基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應用-免費閱讀
【正文】 分批培養(yǎng)時乙酸積累,對hIFNa2b表達有一定抑制作用,流加葡萄糖的策略使得表達期無乙酸積累,提高了hIFNa2b的表達水平。可以看出,加入酵母抽提物,滿足了菌體生長的需要,使得誘導前后均有較高的比生長速率, h1。誘導前培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質消耗較多, h1,升溫誘導后1 h, h1,營養(yǎng)消耗導致hIFNa2b的比生產(chǎn)速率僅27 mg/(g如圖8所示, g/, g/(g圖7 恒pH補料分批培養(yǎng)(FB1)中菌體(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)的變化曲線 Profiles of dry cell weight (◆), residual glucose(■),acetic acid (●) and hIFNa2b (▲) in pHstatfedbatch cultivation (FB1) h達到2 400 mg/L,是分批發(fā)酵的3. 2倍。h)。 結果與討論 分批發(fā)酵在5 L罐中分批培養(yǎng),結果見圖6和表1。h)，每小時根據(jù)菌體濃度調整葡萄糖的流加速率。%的接種量轉接至裝有70 ml LB培養(yǎng)基的500 ml錐形瓶中,相同條件培養(yǎng)9 h,為二級種子。 材料與方法 材料菌株 宿主菌E. coli BL21(DE3)[BFdcm ompT hsdS (rBmB) galλ(DE3)],重組質粒為pBAI,帶有氨芐青霉素耐藥性標記,hIFNa2b基因表達受λPL啟動子和質粒cI857編碼的蛋白調控。工業(yè)中常用于生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白如人胰島素、人生長激素、人干擾素、人白細胞介素和抗體。由此可見，此技術大大減少了工作量，并縮短了篩選時間。DNA重排的最大特點是在反復突變過程中引進了重組這一自然進化中最重要的過程，而且其對可操作的靶序列的長度沒有任何要求，可以達到幾萬kb。引物先在一個模板鏈上延伸，隨之進行多輪變性、短暫復性(延伸)過程。這種方法可以將錯配率最大提高至20％。(3)有目的地擴增突變鏈：設計擴增引物(PCR5和PCR3)，使其3′端堿基分別與錨錠引物引入的突變堿基配對，擴增引物只能退火到突變鏈而不是親本鏈。這2條改進措施為：(1)在第1輪PCR反應中，誘變引物的濃度僅為側引物的1％，以減少誘變引物在第2輪PCR中的干擾作用；(2)在第l輪PCR反應后，亦即第2輪PCR反應前，增加5個循環(huán)的不對稱擴增，這有利于提高其后的擴增效率。近十年來，定點突變技術獲得了長足的發(fā)展，并且在此基礎上又發(fā)展了很多新技術?；蚬こ逃N基因工程育種是在基因水平上，運用人為方法將所需的某一供體生物的遺傳物質提取出來，在離體條件下用適當?shù)墓ぞ呙高M行切割后，與載體連接，然后導入另一細胞，使外源遺傳物質在其中進行正常復制和表達引，與前幾種育種技術相比，基因工程育種技術是人們在分子生物學指導下的一種自覺的、能像工程一樣可預先設計和控制的育種新技術，它可實現(xiàn)超遠緣雜交，因而是最新最有前途的一種育種新技術。三、課程設計報告內容引言基因工程是二十世紀七十年代發(fā)展起來的一種新型生物技術，其發(fā)展從根本上改變了生物技術的研究和開發(fā)應用模式。文中重點介紹了基因工程育種的一般步驟，以及近年來出現(xiàn)的運用基因工程進行定向育種的主要新技術：基因的定點突變，易錯PCR，DAN重排及基因組重排。通過轉入外源基因，微生物和動、植物細胞可以產(chǎn)生出自身原來沒有的蛋白質。(4)重組載體導入受體細胞：其主要途徑有轉化、轉導、顯微注射、電穿孔法、快速冷凍法和炭化纖維介導法等。在上述2組研究者建立的方法中，后者提出的方案更加巧妙、簡單(圖1)。tube megaprimer PCRTAMS定點誘變技術 2003年，Young等報道了一種有目的地擴增突變鏈的定點誘變技術(Targeted amplification of mutant strand，TAMS)。利用PCR過程中出現(xiàn)的堿基錯配進行特定基因隨機誘變的技術就稱為易錯PCR(Error_prone PCR，簡稱EP—PCR)。其操作的原理和步驟如圖4。Hiraga等開發(fā)的SISDC技術在組件內部引入了限制性內切酶識別標記，用相應的限制性內切酶代替DNase I產(chǎn)生重排片段。該技術巧妙地采用了多輪循環(huán)原生質體融合技術，將各種親本制成原生質體融合再生再制成原生質體融合再生)，即遞歸原生質體融合(recursive protoplast fusion)的方法。由于大腸桿菌繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制，大腸桿菌的分子遺傳學背景已相當明了，不斷完善的基因操作技術可將大腸桿菌構建成為用于異源蛋白生產(chǎn)的分子工廠。在大腸桿菌溫度誘導表達外源蛋白的發(fā)酵過程中,如何控制升溫誘導后菌體的生長,提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率,是實現(xiàn)高密度高表達的關鍵。 培養(yǎng)方法種子培養(yǎng) 從20176。補料分批培養(yǎng)過程中,初始葡萄糖耗盡后采用3種不同的葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供應速率流加。取發(fā)酵液于12 000 r/min,4176。h),生產(chǎn)速率為275 mg/(L升溫誘導后,菌體生長明顯減慢,升溫后2 h1, h1相差很大,這與
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