基因工程及其在大腸桿菌生產(chǎn)人干擾素中的應(yīng)用-免費閱讀
【正文】 分批培養(yǎng)時乙酸積累,對hIFNa2b表達有一定抑制作用,流加葡萄糖的策略使得表達期無乙酸積累,提高了hIFNa2b的表達水平。可以看出,加入酵母抽提物,滿足了菌體生長的需要,使得誘導(dǎo)前后均有較高的比生長速率, h1。誘導(dǎo)前培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗較多, h1,升溫誘導(dǎo)后1 h, h1,營養(yǎng)消耗導(dǎo)致hIFNa2b的比生產(chǎn)速率僅27 mg/(g如圖8所示, g/, g/(g圖7 恒pH補料分批培養(yǎng)(FB1)中菌體(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)的變化曲線 Profiles of dry cell weight (◆), residual glucose(■),acetic acid (●) and hIFNa2b (▲) in pHstatfedbatch cultivation (FB1) h達到2 400 mg/L,是分批發(fā)酵的3. 2倍。h)?！〗Y(jié)果與討論 分批發(fā)酵在5 L罐中分批培養(yǎng),結(jié)果見圖6和表1。h)，每小時根據(jù)菌體濃度調(diào)整葡萄糖的流加速率。%的接種量轉(zhuǎn)接至裝有70 ml LB培養(yǎng)基的500 ml錐形瓶中,相同條件培養(yǎng)9 h,為二級種子。 材料與方法 材料菌株 宿主菌E. coli BL21(DE3)[BFdcm ompT hsdS (rBmB) galλ(DE3)],重組質(zhì)粒為pBAI,帶有氨芐青霉素耐藥性標記,hIFNa2b基因表達受λPL啟動子和質(zhì)粒cI857編碼的蛋白調(diào)控。工業(yè)中常用于生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白如人胰島素、人生長激素、人干擾素、人白細胞介素和抗體。由此可見，此技術(shù)大大減少了工作量，并縮短了篩選時間。DNA重排的最大特點是在反復(fù)突變過程中引進了重組這一自然進化中最重要的過程，而且其對可操作的靶序列的長度沒有任何要求，可以達到幾萬kb。引物先在一個模板鏈上延伸，隨之進行多輪變性、短暫復(fù)性(延伸)過程。這種方法可以將錯配率最大提高至20％。(3)有目的地擴增突變鏈：設(shè)計擴增引物(PCR5和PCR3)，使其3′端堿基分別與錨錠引物引入的突變堿基配對，擴增引物只能退火到突變鏈而不是親本鏈。這2條改進措施為：(1)在第1輪PCR反應(yīng)中，誘變引物的濃度僅為側(cè)引物的1％，以減少誘變引物在第2輪PCR中的干擾作用；(2)在第l輪PCR反應(yīng)后，亦即第2輪PCR反應(yīng)前，增加5個循環(huán)的不對稱擴增，這有利于提高其后的擴增效率。近十年來，定點突變技術(shù)獲得了長足的發(fā)展，并且在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了很多新技術(shù)?；蚬こ逃N基因工程育種是在基因水平上，運用人為方法將所需的某一供體生物的遺傳物質(zhì)提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M行切割后，與載體連接，然后導(dǎo)入另一細胞，使外源遺傳物質(zhì)在其中進行正常復(fù)制和表達引，與前幾種育種技術(shù)相比，基因工程育種技術(shù)是人們在分子生物學(xué)指導(dǎo)下的一種自覺的、能像工程一樣可預(yù)先設(shè)計和控制的育種新技術(shù)，它可實現(xiàn)超遠緣雜交，因而是最新最有前途的一種育種新技術(shù)。三、課程設(shè)計報告內(nèi)容引言基因工程是二十世紀七十年代發(fā)展起來的一種新型生物技術(shù)，其發(fā)展從根本上改變了生物技術(shù)的研究和開發(fā)應(yīng)用模式。文中重點介紹了基因工程育種的一般步驟，以及近年來出現(xiàn)的運用基因工程進行定向育種的主要新技術(shù)：基因的定點突變，易錯PCR，DAN重排及基因組重排。通過轉(zhuǎn)入外源基因，微生物和動、植物細胞可以產(chǎn)生出自身原來沒有的蛋白質(zhì)。(4)重組載體導(dǎo)入受體細胞：其主要途徑有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射、電穿孔法、快速冷凍法和炭化纖維介導(dǎo)法等。在上述2組研究者建立的方法中，后者提出的方案更加巧妙、簡單(圖1)。tube megaprimer PCRTAMS定點誘變技術(shù) 2003年，Young等報道了一種有目的地擴增突變鏈的定點誘變技術(shù)(Targeted amplification of mutant strand，TAMS)。利用PCR過程中出現(xiàn)的堿基錯配進行特定基因隨機誘變的技術(shù)就稱為易錯PCR(Error_prone PCR，簡稱EP—PCR)。其操作的原理和步驟如圖4。Hiraga等開發(fā)的SISDC技術(shù)在組件內(nèi)部引入了限制性內(nèi)切酶識別標記，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶代替DNase I產(chǎn)生重排片段。該技術(shù)巧妙地采用了多輪循環(huán)原生質(zhì)體融合技術(shù)，將各種親本制成原生質(zhì)體融合再生再制成原生質(zhì)體融合再生)，即遞歸原生質(zhì)體融合(recursive protoplast fusion)的方法。由于大腸桿菌繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制，大腸桿菌的分子遺傳學(xué)背景已相當(dāng)明了，不斷完善的基因操作技術(shù)可將大腸桿菌構(gòu)建成為用于異源蛋白生產(chǎn)的分子工廠。在大腸桿菌溫度誘導(dǎo)表達外源蛋白的發(fā)酵過程中,如何控制升溫誘導(dǎo)后菌體的生長,提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)速率,是實現(xiàn)高密度高表達的關(guān)鍵。 培養(yǎng)方法種子培養(yǎng) 從20176。補料分批培養(yǎng)過程中,初始葡萄糖耗盡后采用3種不同的葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供應(yīng)速率流加。取發(fā)酵液于12 000 r/min,4176。h),生產(chǎn)速率為275 mg/(L升溫誘導(dǎo)后,菌體生長明顯減慢,升溫后2 h1, h1相差很大,這與
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