【正文】 分批發(fā)酵和不同補料分批發(fā)酵的實驗結(jié)果歸納于表1。圖8　恒pH補料分批培養(yǎng)(FB1)中葡萄糖濃度(■)、葡萄糖流加速率(◆)及葡萄糖比消耗速率(▲)的變化曲線　Profiles of residual glucose(■), feeding rate of glucose (◆) and specific consumption rate of glucose(▲) in pHstat fedbatch cultivation (FB1),表明葡萄糖供應(yīng)的改善提高了hIFNa2b的表達水平, g/(g此補料分批發(fā)酵實驗記為FB1,結(jié)果見圖7和表1。hIFNa2b的電泳測定采用三(羥甲基)甲基甘氨酸(φ=)SDS聚丙烯酰胺三層膠系統(tǒng)分離目的蛋白[6],凝膠用考馬斯亮藍染色,用圖像分析系統(tǒng)(Smart View analysis program,上海復(fù)日科技有限公司)定量。培養(yǎng)基配制所用蛋白胨和酵母抽提物均為Oxoid產(chǎn)品,其余試劑為國產(chǎn)分析純,采用去離子水配制。作為一種成熟的基因克隆表達受體，大腸桿菌被廣泛用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，如基因的分離擴增、DNA序列分析、基因的表達產(chǎn)物功能鑒定等。Ostermie等以核酸外切酶Ⅱ代替DNaseI對靶序列進行消化，發(fā)明了遞減法建立雜交酶技術(shù)（ITCHY)，使得非同源性序列間也能發(fā)生重排，擴大了該技術(shù)的用途。圖2 TAMS定點誘變技術(shù)原理和操作過程Figure 2 The principle and operation process of TAMS1． 易錯PCRDNA聚合酶在進行擴增目的DNA時會以一定的頻率發(fā)生堿基錯配，這一現(xiàn)象恰好提供了一種對特定基因進行隨機誘變的可能方法。該法省去了傳統(tǒng)上以PCR為基礎(chǔ)的定點突變中第1輪PCR產(chǎn)物的純化過程，實現(xiàn)了在同一管中先后進行2輪PCR反應(yīng)的定點突變目標。利用這些技術(shù)，可以直接地、有針對性地在DNA分子水平上改造生物的遺傳性狀。1972年美國的Berg和Jackson等人將猿猴病毒基因組SV 40DNA、λ噬菌體基因以及大腸桿菌半乳糖操縱子在體外重組獲得成功。例如：重疊延伸PCR法(Overlap Extension PCR簡稱EO—PCR)、大引物PCR法(Megaprimer PCR)、一步重疊延伸PCR(One—stepOverlap Extension PCR，簡稱OOE．PCR)、單管大引物PCR(Single—tube Megaprimer PCR)、快速定點誘變法、多位點環(huán)狀誘變法TAMS(Targeted Amplification of Mutant Strand)定點誘變技術(shù)。在多位點的突變試驗中，TAMS誘變技術(shù)應(yīng)該是首選方法。在每一輪PCR循環(huán)中，那些部分延伸的片段可以隨機地與含不同突變的模板進行雜交，使延伸繼續(xù)，并由于模板轉(zhuǎn)換而實現(xiàn)不同模板間的重組，這樣重復(fù)進行直到獲得全長基因片段，重組的程度可以通過調(diào)整時間和溫度來控制。四川抗菌素工業(yè)研究所的徐波等以產(chǎn)量性狀為標記特征，％。培養(yǎng)基　種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母抽提物5 g/L,NaCl 10 g/L),滅菌后加入100 mg/L氨芐青霉素鈉。　測定方法菌體濃度測定采用濁度法,測定波長600 nm處的光密度(OD600),根據(jù)標準曲線計算菌體干重。圖6　分批培養(yǎng)時菌體(◆)、葡萄糖(■)、乙酸(●)及hIFNa2b(▲)的變化曲線　Profiles of dry cell weight (◆), residual glucose(■), acetic acid (●) and hIFNa2b (▲) in batch cultivation 葡萄糖流加對于hIFNa2b生產(chǎn)水平的影響要獲得hIFNa2b的高體積表達水平,則需維持較高的比生產(chǎn)速率,并且增大菌體密度,流加葡萄糖是一種很好的選擇。h) g/(g h后,hIFNa2b表達量即達到5530mg/L,hIFNa2b最大比生產(chǎn)速率為124 mg/(g本文通過優(yōu)化補料分批培養(yǎng)時葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表達量和表達速率。因為期望達到較高的菌體密度,所以生長期較長。進入恒pH補料階段后,菌體比生長速率下降的趨勢進一步明顯, h1。C)洗滌,然后溶于上樣緩沖液中[12mmol/L、pH TrisHCl,甘油(φ=),SDS( g/L),巰基乙醇(φ=),溴酚蘭( g/L]。C下培養(yǎng)10 h,為一級種子?，F(xiàn)在已有100多種異源蛋白通過大腸桿菌基因工程菌實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結(jié)構(gòu)相當復(fù)雜的人體蛋白，如HAS、proUK、MT、MCSF及Hb等。由于此方法是在突變耐受的保守區(qū)直接增加轉(zhuǎn)轍組的幾率，所以其產(chǎn)生的突變頻率大大增加。另外，還可以在該反應(yīng)體系中加入dITP等三磷酸脫氧核苷類似物來控制錯配水平。Ke等在此方法中還提出了2條更為細致、有效的改進措施，使PCR產(chǎn)物的最終產(chǎn)量和純度均有所提高。特別是隨著重組DNA技術(shù)的完善和發(fā)展，以基因水平為核心的現(xiàn)代分子定向育種技術(shù)越來越受到工業(yè)微生物育種學(xué)家的關(guān)注，并展示了良好的應(yīng)