人重組白細胞介素-8在大腸桿菌的表達、鑒定(編輯修改稿)
2024-10-03 10:29 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 w酶、2μl dNTPmix，室溫30分鐘，加50μl酚氯仿異戊醇，混勻，10000rpm 5分鐘離心，取上層液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加100μl無水乙醇、4μl乙酸鈉，混勻，20℃沉底1小時。10000rpm 10分鐘離心，棄上清，100μl 70%乙醇洗滌一次，干燥。加入2μl 10M buffer、2μl %BSA、1μl XbaⅠ，37℃水浴45分鐘。加50μl酚氯仿異戊醇，混勻，10000rpm 5分鐘離心，取上層液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加100μl無水乙醇、4μl乙酸鈉，混勻，20℃沉底1小時。10000rpm 10分鐘離心，棄上清，100μl 70%乙醇洗滌一次，干燥。加20μl TE進一步用于連接反應。B管中加50μl酚氯仿異戊醇，混勻，10000rpm 5分鐘離心，取上層液轉(zhuǎn)至另一Eppendorf管中，加100μl無水乙醇、4μl乙酸鈉，混勻，20℃沉底1小時。10000rpm 10分鐘離心，棄上清，100μl 70%乙醇洗滌一次，干燥。加20μl TE進一步用于連接反應。 DNA連接在Eppendorf管中加入下列物質(zhì)構(gòu)建反應體系進行連接反應：H2O 、10T4 DNA連接酶buffer 、pKpL3α質(zhì)粒DNA 7μl、IL8 PCR產(chǎn)物5μl、T4 DNA連接酶1μl。置1216℃水浴反應過夜。65℃水浴15分鐘，滅活T4 DNA連接酶，用于轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化將無質(zhì)粒大腸桿菌pop2136接種于1ml LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)35小時。待OD600=，8000rpm 2分鐘離心，棄上清。加200μl 100mM Cacl2混勻，冰浴30分鐘。加10μl連接好的質(zhì)粒DNA，混勻，冰浴30分鐘，37℃水浴2分鐘，冰浴2分鐘。加入1ml LB培養(yǎng)基，37℃。取出50μl涂于LA培養(yǎng)皿上（含氨芐青霉素），37℃倒置培養(yǎng)過夜，檢查轉(zhuǎn)化菌是否生成(只有轉(zhuǎn)化的細菌才能在平皿上生長)。 細胞因子的測定—ELISA雙抗體夾心法包被：將稀釋好的包被抗體加入ELISA板，100μl/孔，放置濕盒中，4℃ 24小時。洗滌：加入洗滌液洗滌1分鐘/次，共3次。加樣：加入待測樣品、陰性對照及倍比稀釋的標準品，100μl/孔，放置濕盒中，37℃ 30分鐘。洗滌：同前。加酶標抗體：100μl/孔，100μl/孔，放置濕盒中，37℃ 30分鐘。洗滌：同前。加顯色劑：A液（TMB，四甲基聯(lián)苯胺）1滴，B液（H2O2）1滴，室溫顯色510分鐘。終止反應：加中止液（2mol/L H2SO4）。測OD值：酶標儀測450nm處OD值，以OD值為橫坐標，標準品濃度為縱坐標繪制標準
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