基因工程3大腸桿菌表達系統(tǒng)(編輯修改稿)
2025-06-22 06:00 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 表達的質粒載體構建比較簡單 周質 周質中蛋白質種類較少，純化簡單 信號肽并非總是有助于蛋白質的轉運 蛋白質酶解程度不嚴重 有可能形成包涵體 促進二硫鍵的形成及蛋白質的折疊 蛋白質 N末端結構真實 胞外 蛋白質的酶解作用程度很底 在大腸桿菌細胞中表達的外源真核蛋白通 目標蛋白的純化容易，由于分泌到胞外的 常不會分泌到胞外 蛋白種類少 由于分泌到胞外的蛋白質相當于稀釋，因 增進了蛋白質的折疊作用 此目標蛋白的得率較低 蛋白質 N末端結構真實 * Talmadge和 Gilbert（ 1982）將外源蛋白質在大腸桿菌細胞中的不同部位表達。結果： 細胞質中表達的大鼠胰島素原的半衰期僅有2min左右，而表達在大腸桿菌周質中大鼠胰島素原的半衰期延長了 10倍以上。（ 原因：細胞周質中蛋白酶的含量低 ） 到目前為止，這方面的技術還很不成熟，外泌率低。 * 使克隆基因表達的外源蛋白質分泌到胞外的培養(yǎng)基中，是獲得蛋白質穩(wěn)定性的最佳途徑。 外源蛋白質在大腸桿菌細胞中的穩(wěn)定性 當一種克隆的外源基因在大腸桿菌中不能實現(xiàn)其功能表達時，我們往往會認為這是由于轉錄或翻譯過程發(fā)生了問題。其實在早期的研究中就有許多實驗表明，克隆的外源基因即便是在大腸桿菌中得到了表達，也并不一定就意味著它的多肽產(chǎn)物是穩(wěn)定的。 影響因素包括： （ 1）蛋白質的降解作用 在大腸桿菌的細胞中，含有大量的各種類型的蛋白酶，廣泛分布在細胞質、周質、內(nèi)外膜等部位，參與許多方面的代謝活動，包括選擇性地酶解異常的蛋白質。 已知有許多因素，如 不完全多肽 、 氨基酸取代突變 、多酶復合體亞基的超量合成 、 氧化作用或游離自由基的作用而造成的翻譯后損傷 ， 以及 基因工程技術的效應等，都可以導致蛋白質分子受損或構型變化，形成異常蛋白質。 為了避免在大腸桿菌中發(fā)生外源蛋白質的降解，或將此降解作用控制在最低水平，已針對性發(fā)展出了許多種不同的技術方案。主要有： 1）讓外源蛋白質定位在周質或胞外表達； 2）使用蛋白酶缺陷的大腸桿菌做表達菌株； 3）將轉化有克隆基因的寄主菌株放臵在低溫環(huán)境中生長； 4）使目標基因以融合蛋白形式表達； 5）臵換多肽鏈中某些氨基酸，消除蛋白酶切點； 6）對目標蛋白質作疏水性修飾。 （ 2）結構決定因子與蛋白質的穩(wěn)定性 ? 與蛋白質穩(wěn)定性相關的確切的分子結構特征？ 不清楚 ? 但已經(jīng)明確了若干種影響蛋白質穩(wěn)定性的結構決定因子。 其中最重要的： N端氨基酸性質。 N端氨基酸性質 “N端法則” : 在生物體內(nèi)蛋白質新陳代謝的穩(wěn)定性，主要取決于 N端氨基酸的性質。 在大腸桿菌細胞質內(nèi)，若蛋白質 N端為 Arg、Lys、 Leu、 Phe、 Tyr 和 Trp等殘基，則其穩(wěn)定性較差；而同樣條件下，若 N端為除了前述 6種氨基酸之外的其它任何一種氨基酸殘基時，其穩(wěn)定性則大大提高。 167。 重組操作時， N端增加一個增加穩(wěn)定性的氨基酸 （ 3）表達天然的蛋白質 以形成融合蛋白的形式在大腸桿菌細胞中表達外源真核基因具有許多方面的優(yōu)越性。例如，產(chǎn)物比較穩(wěn)定，可以免受胞內(nèi)蛋白酶的降解作用，可以獲得較高的產(chǎn)率。 Tacon等人在 80年代初期，使用大腸桿菌的trp啟動子和與之相連的 SD序列，構建了兩種有利于表達天然蛋白質的質粒載體。 pWT551和 pWT5
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