第四章基因在大腸桿菌、酵母中的高效的表達(編輯修改稿)
2025-08-17 02:40 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 細菌的 RNA聚合酶不識別真核基因的啟動子； 2. 真核基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA在原核細胞中不能結(jié)合到核糖體上； 3. 真核基因一般含有內(nèi)含子，而原核細胞沒有象真核細胞那樣的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，所以 mRNA中的內(nèi)含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表達出有功能的真核蛋白； 4. 表達的真核蛋白在原核細胞中很不穩(wěn)定，容易被細菌蛋白酶降解破壞。 ⑴ 將真核基因克隆到一個強大的原核啟動子和 SD序列的下游，使得真核基因處于原核調(diào)控體系中。 ⑵采用真核基因的 cDNA序列作為構建表達載體的目的基因，這樣就解決了原核細胞沒有 RNA剪接功能的問題。 ⑶構建載體時，將真核基因插在幾個原核密碼子的后面，翻譯后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，這樣就可以避免被原核蛋白酶的識別和降解，最后可以將融合多肽切除。 構建表達載體的策略 第二節(jié) 克隆基因在大腸桿菌中的表達 R － 35 － 10 SD 編碼序列 Ori Tcr TT 啟動子 起始密碼子 AUG、 GUG、 UUG 終止密碼子 UAAU、 UGA、 UAG ?大腸桿菌表達載體的成份 大腸桿菌基因表達系統(tǒng)的表達載體一般是質(zhì)粒表達載體，含有大腸桿菌內(nèi)源質(zhì)粒復制起始位點和有關序列組成的能在大腸桿菌中有效復制的復制子。 大腸桿菌表達載體的成份 ⑴ 啟動子 要求是：①強啟動子②是誘導性的，如熱誘導和化學誘導。 ⑵轉(zhuǎn)錄終止子 使轉(zhuǎn)錄終止，增強 mRNA的穩(wěn)定性，提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達水平。 尤其是將兩個終止子串聯(lián)，轉(zhuǎn)錄終止功能更強。 ⑶ 核糖體結(jié)合位點 在轉(zhuǎn)錄起始位點下游的一段 DNA序列（ SD，5’AGGAGG3’） (4)篩選標記基因 (5)密碼子的選擇 常見的大腸桿菌表達系統(tǒng) ① T7表達系統(tǒng) T7噬菌 RNA聚合酶能選擇性的激活 T7噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄，其 mRNA合成速率相當于大腸桿菌 RNA聚合酶的 5倍。 ② Lac表達系統(tǒng) 是 β半乳糖苷酶編碼基因 LacZ的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列，該啟動子可以被 IPTG誘導，所以在培養(yǎng)基中加入該安慰誘導物就可以誘導目的基因的表達。 ③ Tac表達系統(tǒng) 是一種由 Lac和 Trp啟動子雜合而成的啟動子，其強
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