基因工程32大腸桿菌克隆載體(編輯修改稿)
2025-02-02 02:22 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 的 β 半乳糖苷酶仍然有著正常的功能。 M13mp2是最簡單的 M13克隆載體 。有 EcoRI黏性末端的 DNA片段可以插入進(jìn)克隆位點，重組體可以通過在 Xgal培養(yǎng)基上的噬菌斑得到識別。 M13mp7—對稱的克隆位點 開發(fā) M13克隆載體的下一步是在 lacZ39?；蛏咸砑宇~外的酶切位點。 通過在試管中合成一個叫做多接頭 (polylinker)的寡核苷酸而實現(xiàn)。 多接頭包含一系列的限制性酶切位點，有一個EcoRI的黏性末端。 多接頭被插入到 M13mp2克隆載體的 EcoRI位點上，形成了一個更加復(fù)雜的載體，即 M13mp7。 M13mp7有 4個可能的克隆位點： EcoRI， BamHI， SalI和 PstI。 為了不完全破壞掉 lacZ?基因，在設(shè)計這個多接頭時，人們使得讀碼框在通過多接頭后沒發(fā)生改變。 這樣，產(chǎn)生的 β 半乳糖苷酶雖然被改變了序列，但仍然有著正常的功能。 用 EcoRI， BamHI， SalI中的任意一種去酶解M13mp7，整個多接頭或其一部分會被切掉。 在其他 DNA存在下，有 3種連接可能發(fā)生： (1)插入的新 DNA， (2)插入的多接頭。 (3)載體自連。 新 DNA的插入會阻礙 β 半乳糖苷酶的產(chǎn)生，因此重組體在含 Xgal的瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生無色透明的噬菌斑。 當(dāng)插入的片段是多接頭時，原來的 M13mp7載體又再次形成了，噬茵斑是藍(lán)色的。 如果是載體自連，噬菌斑應(yīng)該是什么顏色 ? 多接頭又一次顯示其巧妙設(shè)計：不管用哪一個內(nèi)切酶酶解，自連的載體都會連成有功能的 lacZ39。基因，最終形成藍(lán)色的噬菌斑。 因此 ， 只有重組體產(chǎn)生無色透明的噬茵斑。 由于攜帶對稱的克隆位點，無論新的 DNA是通過 BamHI， SalI或 PstI中的哪一個酶切位點插入載體，都可以用 EcoRI從重組后的分子中切除。 更復(fù)雜的 M13載體 越精巧的 M13載體有更復(fù)雜的多接頭被插入到lacZ39?；蛑?。 M13mp8： 它是 pUC8的對應(yīng)物。和 pUC8一樣，它允許插入有不同的兩個黏性末端的 DNA片段。 M13mp8姐妹載體 M13mp9有一個相同的多接頭，但是多接頭的方向相反，這使得它有另外一個優(yōu)點。當(dāng)把一個 DNA片段克隆進(jìn) M13mp8后，可以用兩種限制性內(nèi)切酶把它再切下來，然后把它連入 M13mp9，那么這片段在載體中就有了相反的方向。 這個特點在 DNA測序中很重要，因為核苷酸序列從多接頭的末端一直讀進(jìn)插入的 DNA片段。 通常 從測序?qū)嶒炛兄荒茏x出約 600個堿基 ，如果插入的 DNA超過這個長度，就有一個末端的序列讀不出來。 一種解決的方法就是 把 DNA換個方向，再插入到姐妹載體中 。用這個新得到的克隆，測序?qū)嶒灳涂梢缘玫搅硪欢说男蛄小? 還有其他的 M13載體可成對選擇使用。 與 M13mp8/9很相似的有： M13mplO/11； M13mpl8/19； 但是它們有不同的多接頭，即，有不同的限制性酶切位點。 M13和質(zhì)粒的雜交載體 盡管 M13可以產(chǎn)生單鏈 DNA，這使它顯得非常有用，但它有很大一個缺點。 用 M13作載體時，可以容納的 DNA片段大小非常有限，通常認(rèn)為 100bp是上限，特殊情況下克隆的片段長度可達(dá) 1kb。 為了解決這個問題，人們把 M13基因組的一部分和質(zhì)粒 DNA結(jié)合在一起，構(gòu)建了一種新型的載體，叫做噬菌體質(zhì)粒 (plagemids)。 pEMBL8是一個噬菌體質(zhì)粒 ： 通過把 M13基因組中一個 1 300bp的片段導(dǎo)入pUC8中而構(gòu)建。 M13在形成被分泌的噬菌體顆粒前有一種酶使雙鏈 DNA變成單鏈 DNA，而被導(dǎo)入的那一段 M13 DNA則含有被這種酶識別的信號序列。 雖然這段序列從 M13的基因組中被分離出來，但功能仍然還在。 所以， pEMBL8也可以被轉(zhuǎn)化成單鏈的 DNA，并能以有缺陷的噬菌體顆粒的形式被分泌出來。用作 pEMBL8克隆實驗的宿主大腸桿菌必須隨后被正常的 M13噬菌體感染。正常的 M13噬菌體是作為 輔助噬菌體 (helper phage)，提供必要的復(fù)制酶和蛋白質(zhì)外殼。 pEMBL8由于是從 pUC8發(fā)展來的，同樣也有插入多接頭的 lacZ?基因，重組體可以通過在含有Xgal的培養(yǎng)基上的噬菌斑而被鑒定出來。 可以用 pEMBL8產(chǎn)生長度達(dá)到 10kb的單鏈 DNA片段，這極大地擴(kuò)展了 M13克隆系統(tǒng)的使用范圍。 基于 λ 噬菌體的克隆載體 基于 λ 噬菌體構(gòu)建克隆載體
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